細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是由細(xì)胞分泌的具膜小囊泡，具有多種生物學(xué)功能，已有研究表明，EVs廣泛參與機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原遞呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等過程，在多種疾病和生理過程中扮演重要的角色。由于EVs的來源、分離純化方法等存在差異，導(dǎo)致研究結(jié)果間的重復(fù)性和一致性不佳。制定EVs分離純化和表征標(biāo)準(zhǔn)已然成為各個細(xì)胞外囊泡學(xué)會或團(tuán)體討論的熱點(diǎn)。由中國研究生醫(yī)院學(xué)會發(fā)布的《人間充質(zhì)干細(xì)胞來源的小細(xì)胞外囊泡》和《人多能干細(xì)胞來源的小細(xì)胞外囊泡》兩項團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)自2022年1月1日起正式開始實(shí)施，廈門福流自主研發(fā)的納米流式檢測儀已經(jīng)被納入這兩項標(biāo)準(zhǔn)中，用于干細(xì)胞來源的小細(xì)胞外囊泡的質(zhì)量控制。

本期小編將帶來2022年度細(xì)胞外囊泡研究方法學(xué)的4篇影響因子大于10分的文章，包含不同來源EVs的分離純化、蛋白標(biāo)志物評估、DNA定量分析等，這些文章的共同點(diǎn)是均選用納米流式檢測儀(Nano-Flow Cytometry, NanoFCM)進(jìn)行單個EV的分析。

01 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的凋亡囊泡和外泌體的蛋白組學(xué)分析
 

關(guān)鍵詞
凋亡囊泡、Fas、功能蛋白、A型血友病、間充質(zhì)干細(xì)胞、血小板

研究摘要
凋亡囊泡(apoVs)是一種凋亡細(xì)胞來源的納米級囊泡，在多種病理生理環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用。然而，它們的詳細(xì)特征、生物標(biāo)志物和生物學(xué)特性尚未完全闡明。該研究比較了來自三種不同類型的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)衍生的apoVs和外泌體，包括人骨髓間充干細(xì)胞質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hASCs)和小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mBMSCs)。建立了MSC衍生的apoV的獨(dú)特蛋白質(zhì)圖譜，并確定了apoVs和外泌體在功能性蛋白質(zhì)貨物和表面標(biāo)志物方面的差異。與外泌體相比，鑒定出了13個在apoVs中特異性富集的蛋白，它們可以作為apoVs特異性的生物標(biāo)志物。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)apoVs繼承了凋亡相關(guān)因子Fas等親代細(xì)胞的凋亡印記，通過與血小板的配體FasL結(jié)合以激活血小板功能，從而改善凝血因子VIII敲除小鼠的A型血友病癥狀、挽救凝血障礙。本研究首次系統(tǒng)表征了MSCs來源的apoVs的生物學(xué)特征，為apoVs的研究奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)，并首次闡明了apoVs通過Fas/FasL聯(lián)動機(jī)制激活血小板、糾正凝血障礙的生物學(xué)功能，提示了apoVs在血友病A治療中的潛在應(yīng)用前景。

02 T細(xì)胞突觸囊泡研究新方法

關(guān)鍵詞
T細(xì)胞突觸囊泡，珠狀脂質(zhì)雙分子層，捕獲技術(shù)，表征

研究摘要
免疫突觸(immunological synapse)是抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell, APC)和T細(xì)胞相互作用的過程中，在細(xì)胞與細(xì)胞接觸部位形成的一個特殊結(jié)構(gòu)，是促進(jìn)抗原、共刺激/共抑制、細(xì)胞因子三種激活信號從抗原遞呈細(xì)胞傳遞到T細(xì)胞的分子樞紐。在與抗原遞呈細(xì)胞作用過程中，T細(xì)胞會釋放第四類信號—跨突觸囊泡(trans-synaptic vesicles, tSV)，介導(dǎo)免疫細(xì)胞之間的雙向通信，但是它們作用的具體方式和原理仍不清楚。

該研究開創(chuàng)性地提出了脂質(zhì)雙分子層珠子(Glass Bead Supported Lipid Bilayers, BSLB)作為一種多功能的合成APCs來捕獲、表征tSV，為研究tSV提供了一種新的檢測手段。BSLB可促進(jìn)來自受刺激T細(xì)胞的CD40L的轉(zhuǎn)移，這在被轉(zhuǎn)移的tSV組成的BSLB上留下了突觸印記。該研究發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞外囊泡(EVs)相比，tSV在大小、產(chǎn)量和免疫受體載體上都存在差異。此外，研究發(fā)現(xiàn)PD-L1與TSG101、ADAM10和CD81是決定CD40L囊泡釋放的關(guān)鍵。最后，作者發(fā)現(xiàn)，與EV相比，tSV中有更多的RNA結(jié)合蛋白和更高含量的microRNA，再次驗證了tSV作為細(xì)胞間信使的特殊作用。該研究開發(fā)了一種免疫細(xì)胞間信息傳遞和交流研究的新方法。
 

03 人血清和血漿來源細(xì)胞外囊泡的分離方法及不同亞群的評估

關(guān)鍵詞
生物標(biāo)志物，外泌體，細(xì)胞外囊泡，微囊泡，血漿，血清，亞群

研究摘要
背景
從血液中分離獲得高純度的細(xì)胞外囊泡(EV)對于疾病診斷生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和驗證至關(guān)重要。血清和血漿的來源的EV都有相關(guān)的文獻(xiàn)報道，但鮮有研究對不同來源的EVs進(jìn)行比較。本研究旨在確定血漿和血清中不同EV亞群的存在。

方法
（如圖1所示）采集健康受試者的血液，平行分離血漿和血清。使用ACD（淺黃色）或EDTA（紫色）管收集血漿，而在血凝塊激活劑管中獲得血清。利用以下三種方法純化EV:

①碘克沙醇墊(iodixanol density cushion, IDC)和尺寸排阻色譜法(size exclusion chromatography, SEC)結(jié)合；

②免疫磁珠捕獲系統(tǒng)(immuno-bead capturing, IBC)，抗CD9、抗CD63和抗CD81的磁珠；

③IDC與碘克沙醇密度梯度離心(iodixanol density gradient,IDG)方法結(jié)合。

采用NTA、Western blot、SP-IRIS、常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)和納米流式檢測技術(shù)、ELISA和質(zhì)譜法分析不同分離方法獲得的EV亞群。此外，作者還比較了不同的血漿分離方法獲得的樣品血小板殘留的情況。

結(jié)果
本研究表明，與ACD血漿和血清相比，EDTA血漿中存在更多的CD9+EV，這些EV上存在CD41a，表明它們是從血小板中釋放的。此外，血液中只有極少數(shù)的EV是呈CD63和CD81雙陽性的。CD63+EV富含于血清，而CD81+EV在血漿和血清中都是最罕見的亞群。此外，使用EDTA管收集的血漿比ACD管收集血漿和血清含有更多的殘留血小板，在EV分離前對樣品進(jìn)行兩次離心對于降低血漿中的血小板殘留至關(guān)重要。

結(jié)論
這些結(jié)果表明，人類血液中含有多個攜帶不同四次跨膜蛋白的EV亞群。血液取樣方法，包括抗凝血劑的使用和離心方案的選擇，都可能會影響EV分析，在發(fā)表文章時應(yīng)做詳細(xì)報告。
 

圖1. 實(shí)驗流程示意圖
 

04 利用納米流式檢測儀分析單個細(xì)胞外囊泡的DNA

關(guān)鍵詞
DNA，DNA酶消化，外泌體，細(xì)胞外囊泡，微囊泡，納米流式檢測儀，單顆粒分析

研究摘要
已有研究表明，細(xì)胞外囊泡(EVs)攜帶DNA，然而，EV中DNA(EV-DNA)的許多基本特征仍不清楚。本研究采用納米流式檢測儀(NanoFCM)，散射光通道可檢測粒徑低至40 nm的單個EV的信號，熒光通道可實(shí)現(xiàn)SYTO 16標(biāo)記的單個200 bp的DNA片段的檢測（技術(shù)路線如圖2所示）。通過同時對單個EV進(jìn)行側(cè)向散射和熒光(FL)檢測并結(jié)合酶處理，本研究發(fā)現(xiàn)：

01 游離的DNA或與非囊泡實(shí)體相關(guān)的DNA大量存在于由細(xì)胞培養(yǎng)物制備的EV樣品中（培養(yǎng)基經(jīng)超速離心處理）

02 單個EVs中EV-DNA的數(shù)量表現(xiàn)出很大的異質(zhì)性，DNA陽性(DNA+)EVs的數(shù)量在30%到80%之間變化，具體取決于細(xì)胞類型；

03 外部EV-DNA主要定位在相對較小的EVs上(例如，HCT-15細(xì)胞系<100 nm)，通過抑制外泌體分泌途徑可顯著降低DNA+EVs 的分泌；

04 內(nèi)部EV-DNA主要封裝在相對較大的EV的內(nèi)腔(例如HCT-15細(xì)胞系為80-200 nm)；

05 雙鏈DNA(dsDNA)是外部和內(nèi)部EV-DNA的主要存在形式；

06 EVs中未發(fā)現(xiàn)組蛋白(H3)，EV-DNA與組蛋白不相關(guān)；

07 基因毒性藥物誘導(dǎo)DNA+EVs的釋放增加，外部DNA+EVs和內(nèi)部DNA+EVs的數(shù)量以及單個EVs中的DNA含量均顯著增加。

這項研究為深入了解DNA與EV的相關(guān)性提供了直接和確鑿的實(shí)驗證據(jù)。

圖2. EV-DNA標(biāo)記和NanoFCM分析示意圖

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