肺癌是造成全球癌癥死亡的主要原因�；瘜W療法、放射療法、靶向生物療法以及近年來的免疫療法是肺癌患者的主要治療選擇，但腫瘤與基質成纖維細胞間的某些相互作用會引起肺癌的化療耐藥性，導致癌癥復發(fā)和轉移。因此，了解成纖維細胞與腫瘤之間的通訊無疑將有助于肺癌治療的改善。

近日，鄭州大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學研究中心的研究團隊發(fā)現，鋅轉運蛋白ZIP1陽性（ZIP1⁺）的成纖維細胞通過間隙連接直接與腫瘤細胞相互作用，并導致肺癌化療耐藥。這項研究成果于10月7日發(fā)表在《Nature Communications》雜志上，對肺癌化療的改善具有重要意義。

圖片來源：Nature Communications

（https://www.nature.com/articles/s41467-022-33521-4）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了小鼠肺癌細胞系LLC和人肺癌細胞系A549和H1299，并分離了人癌癥相關成纖維細胞（hCAF），同時也使用了ZIP1缺陷型小鼠（由賽業(yè)生物提供）和異位移植小鼠腫瘤模型。此外，作者采用單細胞RNA測序對基質細胞進行分選，并開展了基因集變異分析（GSVA）和RNA速率分析，最后通過FACS測定了細胞內的Zn²⁺，以及Zn²⁺的吸收和轉移。

技術路線

01 通過scRNA-seq分析CAF在化療后的適應性，發(fā)現Zip1在一個亞群在高水平表達

02 分析ZIP1的表達是否影響間隙連接的形成，發(fā)現ZIP1⁺ CAF與肺癌細胞形成間隙連接

03 ZIP1⁺成纖維細胞作為Zn²⁺儲備庫，通過間隙連接將Zn²⁺轉移至癌細胞中

04 Zn²⁺誘導ABCB1介導的藥物排出，促進肺癌的化療耐藥

05 ZIP1⁺成纖維細胞與肺癌患者的化療耐藥具有臨床相關性

研究結果
1.ZIP1⁺成纖維細胞與肺癌細胞形成間隙連接
癌癥相關成纖維細胞（Cancer-associated fibroblasts, CAF）是異質性的基質細胞，與肺癌化療耐藥有關。之前的研究發(fā)現，成纖維細胞可以直接與腫瘤細胞連接，導致其轉移。還有報道稱，CAF可能與肺癌細胞形成間隙連接（gap junction），以交換代謝物。然而，在化療過程中，間隙連接如何調控成纖維細胞與癌細胞之間的通訊，目前還不大清楚。

在這項研究中，研究人員使用異位移植小鼠腫瘤模型，通過單細胞RNA測序分析CAF在化療后的適應性，發(fā)現了一個成纖維細胞亞群高水平表達Zip1。鋅轉運蛋白ZIP1是溶質載體家族39（SLC39）中的一員，負責維持胞質的鋅濃度。經過化療藥物阿霉素（DOX）處理后，小鼠腫瘤中的Zip1⁺ CAF細胞增加，而其他CAF亞群減少（圖1）。
 

圖1 scRNA-seq顯示DOX處理后Zip1⁺ CAF細胞在腫瘤中富集^[1]

接下來，作者分析了ZIP1在成纖維細胞中的表達是否影響間隙連接蛋白的表達。結果顯示，ZIP1在hCAF中的過表達增加了間隙連接蛋白43（CX43）的表達。相反，小鼠胚胎成纖維細胞中Zip1的敲低則降低了CX43的表達。與Zip1^+/-和Zip1^-/-小鼠相比，Zip1^+/+小鼠也表達更高水平的CX43（實驗所用Zip1缺陷小鼠由賽業(yè)生物提供）。

后續(xù)的分析顯示，CAF上的CX43與腫瘤細胞中的CX43存在物理上的相互作用。熒光染料鈣黃綠素可從成纖維細胞轉移至腫瘤細胞，表明A549腫瘤細胞與hCAF之間形成功能性的間隙連接。在過表達ZIP1后，鈣黃綠素轉移更高效。這些結果表明，ZIP1⁺成纖維細胞通過上調CX43與腫瘤細胞形成有效的間隙連接。

2.ZIP1⁺成纖維細胞將Zn²⁺轉移至癌細胞
考慮到Zn²⁺是ZIP1的底物，研究人員接下來探討了在兩種細胞之間運輸Zn²⁺的可能性。結果顯示，在DOX處理后，腫瘤間隙液中不穩(wěn)定Zn²⁺水平增加，且在用DOX治療的腫瘤中觀察到大范圍的壞死。進一步的分析顯示，CAF能夠吸收紫杉醇化療處理的垂死癌細胞釋放的Zn²⁺，并且吸收量與Zn²⁺的細胞外劑量成正比。此外，與hCAF共培養(yǎng)后，A549腫瘤細胞中的Zn²⁺增加，而庚醇（間隙連接的解偶聯(lián)劑）或TPEN（Zn²⁺螯合劑）的預處理可以降低Zn²⁺梯度（圖2）。研究人員認為，ZIP1⁺成纖維細胞可作為Zn²⁺儲備庫，通過間隙連接將Zn²⁺轉移至癌細胞中。
 

圖2 ZIP1⁺成纖維細胞通過間隙連接將Zn²⁺轉移至癌細胞^[1]

在后續(xù)的分析中，作者發(fā)現CAF中的Zn²⁺以劑量依賴性方式刺激CX43的上調和pAKT的激活。同時，Zn²⁺刺激又導致腫瘤細胞中的CX43表達以時間依賴性和劑量依賴性的方式升高。這些結果顯示，源于成纖維細胞的Zn²⁺通過上調癌細胞中的CX43進一步促進間隙連接的形成。

3.ZIP1⁺成纖維細胞促進肺癌的化療耐藥
那么，Zn²⁺對于腫瘤對藥物的應答有何影響？研究人員發(fā)現，肺癌細胞與CAF細胞的共培養(yǎng)誘導腫瘤細胞表達ABCB1。ABCB1是一種多藥耐藥蛋白，可將多種藥物（包括DOX）排出細胞外，使得腫瘤細胞產生耐藥性。隨后用紫杉醇和TPEN聯(lián)合處理腫瘤細胞。在加入低水平的TPEN后，腫瘤對紫杉醇的敏感性顯著增加。同時，Zn²⁺刺激ABCB1表達并降低DOX在腫瘤細胞內的積累。由此可見，Zn²⁺誘導ABCB1介導的藥物排出，并保護腫瘤細胞免受藥物毒性。

接下來，作者探討了ZIP1⁺成纖維細胞是否對癌細胞具有保護作用。與Zip1^-/-小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）相比，Zip1^+/+MEF減弱了DOX誘導的肺癌細胞的DNA損傷。相應地，Zip1^+/+MEF降低了腫瘤細胞中的DOX，并增加了ABCB1的表達。對于荷瘤小鼠，DOX在Zip1^+/+小鼠腫瘤細胞內的積累顯著低于Zip1^+/-和Zip1^-/-小鼠，而ABCB1在Zip1^+/+小鼠腫瘤細胞內的表達也顯著高于Zip1^-/-細胞。這些結果表明，無論在體外還是體內，ZIP1在成纖維細胞中的表達都賦予了肺癌細胞耐藥性。

最后，研究人員在90名接受化療的肺腺癌患者隊列中進一步研究了ZIP1⁺成纖維細胞與肺癌化療耐藥的臨床相關性。他們發(fā)現，在大多數腫瘤中，ZIP1⁺成纖維細胞的比例超過50%。此外，ZIP1^high成纖維細胞狀態(tài)預示著總生存期和無進展生存期較差，表明ZIP1^high成纖維細胞與肺腺癌的化療耐藥性存在關聯(lián)。在另一組肺腺癌患者中，腫瘤細胞的ABCB1表達與CAF中的ZIP1表達呈正相關。這些結果都表明，ZIP1⁺成纖維細胞通過上調CX43與癌細胞相連接，并通過Zn²⁺轉移來促進化療耐藥（圖3）。
 

研究結論
總的來說，這項研究顯示ZIP1⁺成纖維細胞與肺癌細胞之間通過CX43介導的間隙連接形成短距離的相互作用，并通過Zn²⁺轉移形成化療耐藥性。這些結果對肺癌治療具有重要意義，有望設計出克服化療耐藥性的策略。

原文檢索：
[1]Ni, C., Lou, X., Yao, X. et al. ZIP1⁺ fibroblasts protect lung cancer against chemotherapy via connexin-43 mediated intercellular Zn²⁺ transfer. Nat Commun 13, 5919 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33521-4
 

ZIP1 KO小鼠
（Slc39a1 KO小鼠）

品系名稱：
C57BL/6N-Slc39a1^em1Cya

品系編號：
KOCMP-30791-Slc39a1-B6N-VA

產品編號：
S-KO-09070

應用方向：
發(fā)育生物學，胚胎，增長/尺寸/體型，生理系統(tǒng)，分子生物學

打靶方案：

ZIP1 Flox小鼠
（Slc39a1 Flox小鼠）

品系名稱：
C57BL/6J-Slc39a1^em1(flox)Cya

品系編號：
CKOCMP-30791-Slc39a1-B6J-VA

產品編號：
S-CKO-10210

應用方向：
發(fā)育生物學，胚胎，增長/尺寸/體型，生理系統(tǒng)，分子生物學

打靶方案：

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