2022年11月，北京大學(xué)口腔醫(yī)院國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心聯(lián)合首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院在學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表題為“Midpalatal Suture: Single-Cell RNA-Seq Reveals Intramembrane Ossification and Piezo2 Chondrogenic Mesenchymal Cell Involvement”的研究成果。文章首次使用單細胞測序深入研究了腭中縫區(qū)域，有助于建立腭中縫膜內(nèi)成骨模型，并揭示了Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細胞在骨成熟和重塑過程中的潛在分子特征。
新格元在該研究中承擔了組織保存與解離、單細胞轉(zhuǎn)錄組(GEXSCOPE^®)測序以及單細胞數(shù)據(jù)生信分析等工作。
下面和元小新一起來看一下單細胞如何揭示腭中縫膜內(nèi)成骨模型吧。
 
研究背景
腭中縫是上頜骨寬度生長發(fā)育的主要部位，也是對上頜寬度發(fā)育不足者進行上頜快速擴弓(RME)過程中阻抗的主要來源部位。探索腭中縫成熟骨化過程，闡明其中的潛在機制，有助于確定腭中縫RME的最佳時機與矯形力大小，臨床意義重大。然而，與腭中縫相關(guān)的機制研究很少，目前腭中縫成熟骨化過程未見單細胞測序相關(guān)研究。

 
思維導(dǎo)圖  

研究結(jié)果
1.小鼠模型腭中縫的組織學(xué)染色和Micro-CT分析
隨著周齡的增長，腭中縫的彎曲程度增加，4、5周齡時腭中縫形態(tài)較直，9周齡時較為彎曲。此外，從4周齡至9周齡，腭中縫寬度減小，骨密度(BMD)、骨體積/組織體積(BV/TV)明顯增加。Micro-CT結(jié)果提示，隨著腭中縫成熟骨化，其形態(tài)更加交錯、寬度更窄，骨化程度增加，但需要注意的是，腭中縫在9周齡時仍未融合。組織學(xué)染色觀察驗證了Micro-CT分析結(jié)果，腭中縫區(qū)主要由纖維細胞、纖維和成骨細胞組成，在4周齡時觀察到軟骨細胞，但在5和9周齡時很少見。   2.小鼠模型腭中縫的單細胞RNA測序分析
利用單細胞RNA測序分析腭中縫區(qū)域的細胞和分子組成，質(zhì)量控制后獲得45,677個細胞，包括來自4周齡小鼠的16,686個細胞、來自5周齡小鼠的17,053個細胞、以及來自9周齡小鼠的11,938個細胞。確定了5種主要的細胞類型，包括上皮細胞、間充質(zhì)細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞、以及神經(jīng)細胞(圖2A)。
由于間充質(zhì)細胞在成熟骨化過程中，特別是在骨基質(zhì)形成中作用至關(guān)重要，因此，從整體細胞群中選擇間充質(zhì)細胞進行進一步分析。結(jié)果表明間充質(zhì)細胞由5個不同的簇組成，包括周細胞(標志基因為Acta2、Rgs5、Nes)、成骨向間充質(zhì)細胞(標志基因為Ibsp、Mmp13、Bglap2)、成軟骨向間充質(zhì)細胞(標志基因為Col2a1、Col9a1、Col9a2、Ucma)、成纖維向間充質(zhì)細胞(標志基因為Smoc2、Col8a1、Dpep1)、以及神經(jīng)樣細胞(標志基因為Olig2、Rtn1、Elavl4)(圖2B)。
擬時序與RNA速率分析顯示了各簇間充質(zhì)細胞的分化軌跡，并進一步表明9簇間充質(zhì)細胞處于不同的狀態(tài)。在擬時序分析中，周細胞位于上支，成骨向間充質(zhì)細胞-1(Ost.b1)位于兩個下支，成骨向間充質(zhì)細胞-2 (Ost.b2)和成骨向間充質(zhì)細胞-3(Ost.b3)位于右下支，成纖維向間充質(zhì)細胞-1、2、3(Fib.1、Fib.2、Fib.3)位于左下支(圖2C)。RNA速率分析表明，雖然3個成骨向間充質(zhì)細胞簇起始情況不同，但它們向相同的終點分化(圖2D)。
    3.不同成骨向間充質(zhì)細胞簇在腭中縫膜內(nèi)成骨中的作用
為了描述腭中縫的成骨過程，對成骨向間充質(zhì)細胞進行了差異表達基因(DEGs)和通路分析。Ost.b1的上調(diào)通路與間充質(zhì)發(fā)育和血管生成相關(guān)，Ost.b2的上調(diào)通路與生物礦化和細胞外基質(zhì)組織相關(guān)，Ost.b3的上調(diào)通路與組織重塑、軟骨發(fā)育和破骨細胞分化相關(guān)(圖3A、B)。4周齡的成骨向間充質(zhì)細胞(Ost.b-4w)的上調(diào)通路與細胞增殖相關(guān)，Ost.b-5w的上調(diào)通路與破骨細胞和成骨細胞分化相關(guān)，Ost.b-9w的上調(diào)通路與軟骨內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生相關(guān)(圖3C、D)。
進一步分析三個關(guān)鍵時間點各細胞亞簇內(nèi)成骨向間充質(zhì)細胞的軌跡。結(jié)果表明，Ost.b1主要位于左側(cè)支，Ost.b2主要位于右側(cè)支，Ost.b3分布于左、右分支，這提示每個成骨向間充質(zhì)細胞亞簇處于不同狀態(tài)(圖3E)。RNA速率分析驗證了上述結(jié)果(圖3F)。 4.Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細胞的鑒定
由于軟骨細胞在膜內(nèi)成骨中可能發(fā)揮重要作用，因此，研究者進一步分析了腭中縫區(qū)成軟骨向間充質(zhì)細胞的數(shù)量、百分比與通路富集狀態(tài)(圖4A、B)。這些細胞中上調(diào)的通路與軟骨凝集、結(jié)締組織發(fā)育和機械刺激感受有關(guān)。對成軟骨向間充質(zhì)細胞與其他間充質(zhì)細胞進行差異基因分析，發(fā)現(xiàn)了Piezo2基因的差異表達，這是一個與機械感覺離子通道相關(guān)的經(jīng)典標記基因(圖4C)。Piezo2基因的pct.1(0.35)與pct.2(0.037)差異較大，表明Piezo2是成軟骨向間充質(zhì)細胞的特異性基因(圖4D)。
  5.Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細胞可能與感受機械刺激與傷口愈合有關(guān)
接下來，研究者進行DEGs與通路富集分析，以明確Piezo2⁺和Piezo2^-成軟骨向間充質(zhì)細胞之間的轉(zhuǎn)錄差異(圖5A、B)。與Piezo2^-相比，Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細胞的機械刺激相關(guān)基因(Junb、Fos、lers)表達量更高，并且似乎與傷口愈合、對成纖維細胞生長因子的反應(yīng)、間充質(zhì)干細胞和軟骨細胞分化等相關(guān)(圖5C、D)。對Piezo2進行免疫組化染色，驗證了Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細胞的存在，佐證了上述結(jié)果(圖5E)。    
結(jié)論
為了探索腭中縫成熟骨化過程的潛在機制，本研究建立了一種小鼠腭中縫模型，結(jié)合經(jīng)典的組織學(xué)染色分析、Micro-CT分析、以及前沿的單細胞測序分析，明確了腭中縫的細胞與分子組成。本研究首次使用單細胞RNA測序?qū)﹄裰锌p中的細胞群和成骨過程進行了表征，并發(fā)現(xiàn)了Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細胞群，提示間充質(zhì)細胞有潛力參與腭中縫的成熟骨化過程。成骨向間充質(zhì)細胞分為3個簇(Ost.b1、Ost.b2、Ost.b3)，在膜內(nèi)成骨過程中發(fā)揮多種作用。間充質(zhì)細胞增殖、聚集(Ost.b1)、并分化為成骨細胞(Ost.b1、Ost.b2、Ost.b3)；成骨細胞形成骨化中心，分泌類骨質(zhì)，誘導(dǎo)骨礦化(Ost.b2)，并轉(zhuǎn)化為骨細胞；骨重建貫穿整個過程(Ost.b3)(圖6)。此外，Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細胞可能與感受機械刺激有關(guān)，并有潛力在腭中縫成骨過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。總之，本文對腭中縫成熟骨化過程的研究具有創(chuàng)新性的重要意義。
   
參考文獻
Lu Gao, Tiansong Xu , Liqi Zhang，et al. Midpalatal Suture: Single-Cell RNA-Seq Reveals Intramembrane Ossification and Piezo2 Chondrogenic Mesenchymal Cell Involvement.2022 Nov 12;11(22):3585.