期刊名稱：Biomaterials Research

原文標(biāo)題：Renal clearable bone-targeted contrast agents for theranostic imaging

作者：Haoran Wang，Homan Kang，Kai Bao*，Hak Soo Choi*，et,al.

發(fā)表單位：沈陽(yáng)藥科大學(xué)無(wú)涯創(chuàng)新學(xué)院；Massachusetts General Hospital

發(fā)表時(shí)間：2022年8月

DOI：https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1889233/v1

研究背景

近紅外(NIR)熒光成像技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，由于近紅外光的吸收和散射較低，是用于檢查骨折、骨損傷和關(guān)節(jié)異常等骨疾病理想的成像窗口。

哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院與麻省總醫(yī)院Kang博士/Hak Soo Choi博士研究團(tuán)隊(duì)基于結(jié)構(gòu)固有靶向性(SIT)策略，對(duì)某種NIR-I區(qū)熒光染料進(jìn)行了修飾，使其能夠同時(shí)在NIR-I和NIR-II區(qū)各有一個(gè)峰值，被用于活體體內(nèi)成像。

2022年10月發(fā)表于《Biomaterials Research》，我們對(duì)文章中近紅外熒光成像的有關(guān)應(yīng)用進(jìn)行解讀，為活體成像實(shí)驗(yàn)提供更多的參考。
研究方法

研究人員用硫取代中間碳原子，合成了骨靶向近紅外熒光團(tuán)，發(fā)生紅移并增加了熒光強(qiáng)度。對(duì)新合成的骨靶向近紅外熒光團(tuán)水溶液依次進(jìn)行了物理化學(xué)、光學(xué)和熱穩(wěn)定性的研究。在動(dòng)物模型中進(jìn)行了鈣結(jié)合、骨靶向特異性、生物分布、藥代動(dòng)力學(xué)、2D和3D熒光斷層掃描成像。

動(dòng)物模型

CD-1小鼠（6-8周齡，雄性）、NCr Nu/Nu裸鼠（6周，雄性）在成像前5天喂食無(wú)葉綠素的鼠糧，以減少自發(fā)熒光。為了研究體內(nèi)分布和清除情況，配置0.25-1.0mM近紅外熒光團(tuán)注射用液。

成像前4h異氟醚麻醉，眼靜脈叢注射近紅外熒光團(tuán)100μl (25-100nmol)。NIR熒光成像后處死小鼠，取心、肺、肝、胰腺、脾、腎、十二指腸、小腸和肌肉等主要器官，進(jìn)行組織成像。

近紅外熒光成像

為了評(píng)價(jià)骨靶向能力、體內(nèi)分布以及腎臟清除率。20g CD-1小鼠經(jīng)靜脈注射50nmol (2.5mg/kg) P800SO3-Cl、P800SO3-SH和P800SO3-PEG；注射4h后，移除所有內(nèi)臟器官，仰臥姿勢(shì)固定，進(jìn)行全身骨成像。

為了評(píng)價(jià)P800SO3-PEG骨靶向結(jié)合穩(wěn)定性。NCr Nu/Nu裸鼠，眼靜脈叢注射P800SO3-PEG 50nmol (2.5mg/kg)，利用NIR-II區(qū)成像和NIR-I三維熒光斷層掃描成像系統(tǒng)分別進(jìn)行兩次成像，分別觀察骨信號(hào)隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化。

我們對(duì)文章中近紅外成像設(shè)備技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了整理歸納，見(jiàn)下表：

 

表1.近紅外成像設(shè)備技術(shù)參數(shù)設(shè)計(jì)

NIR-I 區(qū)成像		NIR-II 區(qū)成像
激發(fā)光 (11mW/cm2)	760nm	光纖耦合激發(fā)光 (35mW/cm2)	808nm
長(zhǎng)通濾光片	785nm	長(zhǎng)通濾光片	1070nm
白光	400–650nm	拍攝相機(jī)	640×512-pixel
三維熒光斷層掃描成像
CT 掃描參數(shù)		FLECT 掃描參數(shù)
管電壓	31 kV	激發(fā)光	780nm
管電流	500 µA	濾光片	853nm
曝光時(shí)間	150 ms	曝光時(shí)間	17.5 ms
360°覆蓋掃描	720 幀投影	360°覆蓋掃描	116幀投影
圖像分辨率	25×25×25 um	圖像分辨率	1×1×1 mm
時(shí)長(zhǎng)	15min	時(shí)長(zhǎng)	33 min 12s
TriFoil Imaging VivoQuant v2.5:結(jié)合CT 、FLECT掃描數(shù)據(jù)重建三維圖像

定量分析

對(duì)成像結(jié)果感興趣區(qū)域(ROI)，進(jìn)行熒光/背景的量化。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，至少分析三只小鼠，通過(guò)Image J計(jì)算信號(hào)背景比(SBR)。結(jié)果用非配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；數(shù)據(jù)使用Prism9.2.0可視化。

SBR=熒光強(qiáng)度/背景；其中背景是鄰近組織的信號(hào)強(qiáng)度，如肌肉或皮膚等

骨組織近紅外熒光顯微鏡

為了測(cè)定近紅外熒光團(tuán)的骨組織分布，CD-1小鼠注射100ul P800SO3-PEG（50nmol），分別于第1天和14天取小鼠骨組織。修剪解剖骨組織，直接包埋于Tissue-Tek OCT中，-80℃冷凍保存。用冷凍切片機(jī)切割10μm的冷凍切片。對(duì)切片進(jìn)行熒光分析后進(jìn)行HE染色。

設(shè)置成像參數(shù)：710±25nm的激發(fā)濾光片、785nm二向色鏡和810±20nm的發(fā)射濾光片，調(diào)整曝光度和視野成像。

部分研究結(jié)果

結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與光學(xué)性質(zhì)

與P800SO3相比，其他三組改進(jìn)的近紅外熒光團(tuán)均顯示出明顯的NIR-II信號(hào)，并且λem隨著取代基團(tuán)能量的減少而增加，能夠使熒光尾發(fā)射區(qū)域從NIR-I延伸到NIR-II窗口(NIR-I：Ex760nm，Em785nm；NIR-II：Ex808nm，Em1,070nm)。

當(dāng)二磷酸七甲胺中間C原子被取代后，可以有效提高NIR窗口的最大吸收波長(zhǎng)和紅移系數(shù)，增加熒光強(qiáng)度(λemP800SO3=802nm；λemP800SO3-Cl=817nm；λemP800SO3-SH=845nm；λemP800SO3-PEG=847 nm)（圖1)。

 

圖1.骨靶向造影劑結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與光學(xué)性質(zhì)

P800SO3-PEG是NIR-I區(qū)花菁染料修飾后，發(fā)生紅移并增加熒光強(qiáng)度，能夠在NIR-I和NIR-II兩個(gè)窗口進(jìn)行熒光成像。改善了光學(xué)性能，提高了光照敏感性，增強(qiáng)激發(fā)后產(chǎn)生的光熱效應(yīng)（圖2）。

 

圖2.骨靶向造影劑-P800SO3-PEG

骨靶向性和體內(nèi)分布

CD-1小鼠摘除所有內(nèi)臟器官后，仰臥姿勢(shì)進(jìn)行全身骨成像。結(jié)果表明，小鼠的胸椎、腰椎和骶椎，以及背側(cè)肋骨、髂骨和膝關(guān)節(jié)部位，均表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光信號(hào)（圖3a，b）。

P800SO3-Cl在肌肉和皮膚中表現(xiàn)出較高的非特異性結(jié)合，SBR最低(NIR-I，2.3；NIR-II，3.9)。P800SO3-PEG的背景信號(hào)最低，骨靶向結(jié)合效果最好；NIR-II窗口組織散射較低，SBR值(SBR≈6.0)顯著高于NIR-I(SBR≈3.5)(圖3c)。

研究人員比較了P800SO3-PEG在兩個(gè)NIR窗口成像的分辨率，進(jìn)行小鼠尾椎骨精細(xì)成像(圖3d)。可以看到，NIR-II的尾椎骨圖像SBR值為2.4，比NIR-I(SBR≈1.3)高2倍左右;FWHM在NIR-II為100±0.01mm（圖3e）。

圖3.P800SO3-Cl、P800SO3-SH和P800SO3-PEG骨靶向性和體內(nèi)分布成像

（a）全身骨成像

（b）膝關(guān)節(jié)成像；color (上)，NIR-I (中)，NIR-II (下）；

（c）骨膝關(guān)節(jié)及臨近肌肉組織的SBR值(n = 3, mean ± S.D)；

（d）尾骨NIR-I和NIR-II成像結(jié)果

（e）對(duì)圖d白色虛線標(biāo)記的區(qū)域進(jìn)行FWHM 分析

P800SO3-PEG 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

研究人員為了評(píng)價(jià)腎臟清除率，通過(guò)對(duì)CD-1小鼠眼靜脈叢注射P800SO3-PEG（25 nmol），測(cè)定血液中P800SO3-PEG動(dòng)態(tài)變化（圖4a）

結(jié)果表明，P800SO3-PEG的體內(nèi)分布和清除速度較快(t1/2α=1.53min，t1/2β=21.7min）。此外，P800SO3-PEG曲線下面積(AUC)較小，清除率較高(0.23mL/min)，能夠在4h內(nèi)快速代謝清除(4% ID)。

P800SO3-PEG骨基質(zhì)結(jié)合穩(wěn)定性

研究人員選用NCr Nu/Nu 裸鼠，靜脈注射P800SO3-PEG (50nmol，2.5 mg/kg)后，觀察14天內(nèi)骨基質(zhì)信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化(圖4b)。

P800SO3-PEG能夠靶向結(jié)合小鼠的顱骨、肩胛骨、脊椎、髂骨和部分股骨；熒光強(qiáng)度逐漸升高，并在第4天達(dá)到峰值；能夠穩(wěn)定與顱骨、脊椎等骨基質(zhì)結(jié)合。

圖4c 比較了CD-1小鼠，靜脈注射 P800SO3-PEG第1天和14天小鼠的膝蓋、顱骨、脊椎和尾椎骨成像，觀察骨信號(hào)分布隨時(shí)間的變化（圖c）：

1）在膝關(guān)節(jié)中，骨骺和干骺是骨代謝活躍區(qū)域，隨著時(shí)間的推移，信號(hào)減少或消失，并重新分布到脛骨和股骨中。2）生長(zhǎng)板（軟骨）中沒(méi)有信號(hào)。3)顱骨和上頜骨，邊緣輪廓信號(hào)隨著時(shí)間的推移變得更加明顯，如脊椎(包括胸椎，腰椎和骶椎) ，髂骨和部分背側(cè)肋骨。4）棘突中的信號(hào)逐漸減少，而橫突中的信號(hào)維持不變。5）裸鼠的精確尾椎骨成像，P800SO3-PEG積聚兩周后，每節(jié)尾錐表現(xiàn)出明顯區(qū)分的高信號(hào)強(qiáng)度。6）椎間盤(pán)（纖維軟骨）中沒(méi)有熒光信號(hào)。

第1天的骨縱向分析顯微鏡結(jié)果表明(圖4d)，骨表面的熒光信號(hào)為軟骨(白色箭頭)，注射后第14天的成像結(jié)果表明，P800SO3能夠穩(wěn)定地融入骨基質(zhì)中(黃色箭頭)。隨著時(shí)間的推移，游離的P800SO3-PEG沉積在正常骨基質(zhì)頂部。松質(zhì)骨的微結(jié)構(gòu)圖像分析表明，該區(qū)域有著高周轉(zhuǎn)率(即藍(lán)色虛線)或延遲的新骨沉積(無(wú)熒光)。

圖4.P800SO3-PEG骨基質(zhì)結(jié)合穩(wěn)定性

（a）P800SO3-PEG藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)；

（b）P800SO3-PEG在裸鼠體內(nèi)的生物分布(n = 3, mean ± S.D)；

（c）P800SO3-PEG第1天和14天骨基質(zhì)NIR-II成像

（d) 切除的骨組織進(jìn)行H&E和NIR成像

P800SO3-PEG的三維熒光斷層掃描成像結(jié)果

研究人員通過(guò)三維活體斷層掃描InSyTe FLECT/CT成像系統(tǒng)，檢測(cè)了NCr Nu/Nu 裸鼠在靜脈注射P800SO3-PEG (100nmol，2.5mg/kg）后第4天，在NIR-I區(qū)體內(nèi)生物分布成像。

FLECT/CT成像結(jié)果表明，P800SO3-PEG在注射后4天時(shí)表現(xiàn)出明顯的骨靶向結(jié)合，主要集中在脊椎和骨關(guān)節(jié)中。

在不同骨組織中，優(yōu)先積累在骨代謝活躍區(qū)域；腎臟殘留的弱信號(hào)，說(shuō)明P800SO3-PEG具有穩(wěn)定快速的腎清除率。冠狀位和矢狀位圖像表明，P800SO3-PEG能夠在膝蓋、肩胛骨和脊椎中大量積累，未表現(xiàn)出其它組織的非特異性結(jié)合。

 

圖5.P800SO3-PEG的三維熒光斷層掃描成像

（a）活體成像-全身成像；

（b、c）冠狀位、矢狀位和橫截面區(qū)域成像

研究結(jié)論

P00SO3-PEG 是具有骨靶向的花菁素?zé)晒馊玖希瑢?duì)骨組織具有較高的親和力和成像能力，主要器官的非特異性結(jié)合最小，激光照射時(shí)具有光熱效應(yīng)。P800SO3-PEG是近紅外成像的最佳骨靶向造影劑，具有在實(shí)時(shí)和非放射性骨成像的應(yīng)用潛力，有堅(jiān)實(shí)的用于診斷治療臨床轉(zhuǎn)化前景。

活體近紅外成像在此研究項(xiàng)目中的應(yīng)用

P800SO3-PEG的熒光發(fā)射波長(zhǎng)主要集中在NIR-I 區(qū)，研究人員對(duì)全身骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行NIR-I區(qū)的三維熒光斷層掃描成像，檢測(cè)在不同骨組織中的生物分布。

傳統(tǒng)小動(dòng)物2D成像設(shè)備做不到文章中無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)骨組織NIR-I區(qū)熒光成像，是因?yàn)榻M織穿透低，熒光信號(hào)會(huì)被皮毛、肌肉、血液等背景熒光阻擋。

Trifoil FLECT/CT有效地解決了NIR-I區(qū)組織穿透限制這一成像難題，能夠?qū)?/span>深層組織、器官進(jìn)行高分辨率成像。通過(guò)熒光斷層掃描技術(shù)，獲得真實(shí)的三維圖像和數(shù)據(jù)，能夠重建骨結(jié)構(gòu)精細(xì)圖像。同時(shí)能夠多維度進(jìn)行ROI區(qū)域放大分析，為科研人員提供更高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

若您想要了解更多關(guān)于FLECT/CT成像系統(tǒng)的內(nèi)容，或預(yù)約使用FLECT/CT設(shè)備進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，歡迎您通過(guò)以下方式聯(lián)系我們：

孫元元（技術(shù)部）
Tel：13810818543
柴丹（銷(xiāo)售部）
Tel：13810910943
田建華（應(yīng)用工程師）
Tel：18302907782
張婷瑞（應(yīng)用工程師）
Tel：13910490151
聯(lián)系郵箱：sales@bio-one.cn

訪問(wèn)以下網(wǎng)站了解更多關(guān)于小動(dòng)物3D熒光斷層掃描成像的詳細(xì)內(nèi)容：https://www.trifoilimaging.com
    作為TriFoil Imaging在中國(guó)的銷(xiāo)售服務(wù)商和技術(shù)服務(wù)中心，承接了TriFoil Imaging收購(gòu)的前公司所有設(shè)備維修、維護(hù)，包括GE公司的小動(dòng)物CT、SPECT/CT以及BioScan公司的光學(xué)成像系統(tǒng)。歡迎您關(guān)注我們的微信公眾號(hào)以查看更多相關(guān)報(bào)道。歡迎您就產(chǎn)品、應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)等感興趣的方面與我們交流。