2022年10月，南京醫(yī)科大學(xué)及南京中醫(yī)藥大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在Cell Reports上發(fā)表題為“Gasdermin D restricts anti-tumor immunity during PD-L1 checkpoint blockade”的研究成果。本文系統(tǒng)地研究了GSDMD介導(dǎo)的固有免疫細(xì)胞焦亡對(duì)腫瘤免疫的影響及其作用機(jī)制，為GSDMD/PD-L1檢查點(diǎn)阻斷聯(lián)合治療提供新依據(jù)。
新格元參與該項(xiàng)研究中單細(xì)胞捕獲(Singleron Matrix^®Single Cell Processing System)、單細(xì)胞文庫(kù)構(gòu)建(GEXSCOPE^® Single Cell RNA Library Kits)及生信分析工作。
 
研究背景
腫瘤微環(huán)境(TME)影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對(duì)免疫療法的響應(yīng)。CD8 T細(xì)胞(CTL)對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制和清除至關(guān)重要。臨床發(fā)現(xiàn)大量患者對(duì)抗PD-1/PD-L1療法無(wú)響應(yīng)，提示CD8 T細(xì)胞效應(yīng)功能下降可能存在其他調(diào)控機(jī)制。
Gasdermins家族蛋白在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡和腫瘤免疫調(diào)控作用已有較多報(bào)道。Gasdermin D(GSDMD)是細(xì)胞焦亡的主要效應(yīng)分子，是經(jīng)典和非經(jīng)典炎癥小體共有的關(guān)鍵下游效應(yīng)蛋白，主要表達(dá)于固有免疫抗原呈遞細(xì)胞(APC)，其在抗腫瘤免疫和CD8 T細(xì)胞反應(yīng)中的作用機(jī)制尚不清楚。
 
思維導(dǎo)圖  
研究方法
TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出與免疫檢查點(diǎn)表達(dá)相關(guān)的Gasdermin蛋白家族；用B16F10細(xì)胞系構(gòu)建小鼠腫瘤模型；流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同免疫細(xì)胞表型鑒定；構(gòu)建全敲除小鼠(Gsdmd^-/-、cGas^-/-及Gsdmd^-/-cGas^-/-)及髓系細(xì)胞特異性敲除小鼠(Gsdmd^fl/fl、Cx3cr1-Cre)驗(yàn)證基因功能；各實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤組織解離后通過(guò)流式分選富集免疫細(xì)胞并進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序；免疫熒光共聚焦成像驗(yàn)證GSDMD在各類免疫細(xì)胞的表達(dá)情況。
 
研究結(jié)果
1.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)性分析及Gsdmd-/-小鼠對(duì)PD-L1抑制劑的響應(yīng)情況
作者首先通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析Gasdermin蛋白家族成員在人和小鼠各類免疫細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Gasdermin D總體表達(dá)水平最高，尤其在髓系細(xì)胞。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)收集的所有癌癥數(shù)據(jù)中，Gasdermin D的表達(dá)與多個(gè)免疫檢查點(diǎn)分子(如PDCD1、CTLA4及CD244等)表達(dá)正相關(guān)。此外，通過(guò)GEPIA2預(yù)后數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)33種不同癌種的分析發(fā)現(xiàn)GSDMD高表達(dá)與腫瘤患者總生存期負(fù)相關(guān)(圖1 D-F ACC、LGG及UVM3個(gè)癌種的GSDMD表達(dá)和患者預(yù)后)。
通過(guò)檢測(cè)GSDMD在多個(gè)腫瘤細(xì)胞系(B16F10、 MC38、GL261 及MCA205)的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在B16F10細(xì)胞系的水平最低，選擇該細(xì)胞系研究GSDMD對(duì)抗腫瘤免疫抑制的調(diào)控作用。構(gòu)建Gsdmd^-/-小鼠并構(gòu)建黑色素瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)化療藥物奧沙利鉑可以提高WT及Gsdmd^-/-小鼠抗腫瘤效果，但兩組小鼠對(duì)化療藥物的響應(yīng)沒(méi)有顯著差別。Gsdmd^-/-小鼠PD-L1阻斷治療效果較野生型小鼠好(腫瘤體積變小，免疫檢查點(diǎn)阻斷后生存期變長(zhǎng))。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明GSDMD敲除后I型干擾素及PD-1⁺TIM-3^-T細(xì)胞比例上升，TIM-3⁺及TIGIT⁺CD8⁺ T細(xì)胞減少，CD4 T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞比例上升。此外表達(dá)MHC II的樹(shù)突細(xì)胞及巨噬細(xì)胞比例增加，骨髓來(lái)源抑制性細(xì)胞(MDSCs)比例顯著下降。以上結(jié)果說(shuō)明GSDMD缺失可顯著提高PD-L1阻斷介導(dǎo)的CD8 T細(xì)胞抗腫瘤免疫響應(yīng)。
  2.GSDMD缺失可提高腫瘤組織對(duì)PD-L1阻斷劑的響應(yīng)
研究人員在ImmGen數(shù)據(jù)庫(kù)分析GSDMD在小鼠各類免疫細(xì)胞的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞中高表達(dá)。共聚焦原位成像分析驗(yàn)證了該結(jié)果(圖2B-C)，提示GSDMD通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞來(lái)抑制PD-L1的抗腫瘤效果。為了驗(yàn)證這一猜想，構(gòu)建了條件性敲除小鼠(Gsdmd^fl/fl、Cx3xr1-Cre)。敲除GSDMD并不會(huì)影響腫瘤進(jìn)展，但是可以提升PD-L1的治療效果(圖2D-E)。流式分析發(fā)現(xiàn)這類小鼠腫瘤組織中CD8 T細(xì)胞比例顯著上升，尤其是IFN-γ⁺和TNF-α⁺CD8⁺ T細(xì)胞(圖2F-J)。此外CD8 T細(xì)胞T-bet、Ki-67及TCF表達(dá)水平上升，表現(xiàn)出增強(qiáng)的毒性T細(xì)胞及干細(xì)胞特征。同樣PD-1⁺TIM-3^-非耗竭性CD8 T細(xì)胞比例上升，PD-1⁺TIM-3⁺耗竭性CD8 T細(xì)胞及TIGIT⁺CD8⁺ T比例下降(圖2N-P)。和此前的結(jié)果一致，表達(dá)MHC II的樹(shù)突細(xì)胞及巨噬細(xì)胞比例上升，MDSCs比例下降。這些研究結(jié)果表明抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)的GSDMD在PD-L1阻斷治療過(guò)程中對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞及抗原呈遞細(xì)胞的擴(kuò)張起負(fù)調(diào)控的作用。
  3.GSDMD缺失通過(guò)APC細(xì)胞ISG程序促進(jìn)CD8 T細(xì)胞的抗腫瘤免疫
為了闡明GSDMD抑制APC細(xì)胞抗腫瘤免疫治療的分子機(jī)制，研究人員從腫瘤組織中分離出免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。無(wú)監(jiān)督分群將TME的免疫細(xì)胞分為16個(gè)亞群，兩組小鼠的免疫細(xì)胞在降維圖上邊界明顯，說(shuō)明它們基因表達(dá)特征差異較大。和流式結(jié)果一致，GSDMD敲除小鼠高表達(dá)和效應(yīng)T細(xì)胞和記憶祖細(xì)胞相關(guān)的分子。此外MDSCs和遷移性DC細(xì)胞比例下降，已有研究表明這些細(xì)胞可以抑制CD8 T細(xì)胞的抗腫瘤作用。因?yàn)镃D8 T細(xì)胞是腫瘤進(jìn)展中關(guān)鍵的細(xì)胞類型，研究人員進(jìn)一步分析了它和其他細(xì)胞的通訊情況。結(jié)果顯示Mac-4及migDC這兩類細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞的互作評(píng)分最高(圖3C)，巧合的是這兩類細(xì)胞ISG基因集評(píng)分也高于其他細(xì)胞類型，且敲除小鼠的ISG表達(dá)水平更高(圖3E)。另外注意到Mac-4和migDCs這兩類細(xì)胞是通過(guò)抗原呈遞相關(guān)的受配體與CD8 T進(jìn)行細(xì)胞通訊，先前的研究表明干擾素刺激會(huì)促進(jìn)抗原呈遞，這和單細(xì)胞分析結(jié)果是一致的。GSDMD敲除小鼠的幾個(gè)免疫細(xì)胞亞群比對(duì)照組有較高的抗原呈遞相關(guān)蛋白表達(dá)(圖3F-G)。分離出髓系細(xì)胞用B16F10腫瘤細(xì)胞的DNA進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行qPCR及流式檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)接收腫瘤刺激信號(hào)后GSDMD敲除小鼠來(lái)源的髓系細(xì)胞ISG基因集相關(guān)蛋白(圖3H-I)及pTBK1和IRF3表達(dá)水平升高。以上結(jié)果表明GSDMD通過(guò)調(diào)節(jié)APC細(xì)胞中ISG的基因表達(dá)從而發(fā)揮抑制抗原呈遞及CD8 T細(xì)胞的抗腫瘤作用。
  4.GSDMD缺陷可增強(qiáng)PD-L1抑制劑處理時(shí)依賴cGAS的抗腫瘤免疫效果
已有的研究表明在結(jié)腸炎及F.novicida感染時(shí)GSDMD是c-Gas介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控分子。TME的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)吞噬胞外腫瘤DNA分子激活cGAS-STING信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)ISG的響應(yīng)�；�于這些研究基礎(chǔ)，研究人員構(gòu)建了Gsdmd^-/-cGas^-/-雙敲除小鼠驗(yàn)證GSDMD的促癌作用是否依賴c-GAS。GSDMD敲除小鼠腫瘤體積變小且生存期較長(zhǎng)，而雙敲除小鼠沒(méi)有明顯的抗腫瘤特征(圖4A-B)。和表型結(jié)果一致，進(jìn)一步的流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)雙敲除小鼠腫瘤組織中表達(dá)INFα和INFγ的CD8 T細(xì)胞比例及表達(dá)水平都要低于Gsdmd^-/-單敲小鼠(圖4C-G)。此外，雙敲除小鼠中耗竭相關(guān)marker如TIM-3及TIGIT表達(dá)上調(diào)(圖4H-J)，表達(dá)MHC II的DC及巨噬細(xì)胞比例也顯著下降(圖4K-L)，而MDSCs細(xì)胞比例顯著上升(圖4M)。這些數(shù)據(jù)一致表明GSDMD通過(guò)抑制cGAS途徑來(lái)推動(dòng)腫瘤進(jìn)展。
  5.藥物抑制GSDMD結(jié)合PD-L1抑制劑處理顯著提高抗腫瘤免疫效果
此前有研究報(bào)道富馬酸二甲酯(DMF)可以抑制經(jīng)典細(xì)胞焦亡通路中GSDMD被caspase1切割及后續(xù)的活化過(guò)程。用PD-L1抑制劑聯(lián)合DMF處理荷瘤小鼠，小鼠的腫瘤體積減小生存期延長(zhǎng)(圖5A-B)。同時(shí)，總CD8 T細(xì)胞及產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞比例較PD-L1抑制劑單藥處理組上升(圖5C-G)，且耗竭特征T細(xì)胞比例下降(圖5H-I)。同時(shí)DMF和PD-L1抑制劑聯(lián)合處理后腫瘤組織中表達(dá)MHC II的DC及巨噬細(xì)胞比例上升，MDSCs細(xì)胞比例下降(圖5J-L)。此前有報(bào)導(dǎo)mTORC1可以調(diào)節(jié)GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑，作者用mTORC1/2抑制劑AZD2014處理荷瘤的野生型小鼠及Gsdmd^-/-小鼠，結(jié)果表明阻斷GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑可提高PD-L1的抗腫瘤效果。  
結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)APC中的GSDMD缺失可顯著提高PD-L1阻斷介導(dǎo)的CD8 T細(xì)胞抗腫瘤效果，其以cGAS依賴性方式促進(jìn)APC細(xì)胞的抗原提呈能力。首次將焦亡效應(yīng)分子GSDMD鑒定為在腫瘤微環(huán)境中影響CD8 T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的限制因子，突出免疫細(xì)胞焦亡效應(yīng)在調(diào)節(jié)CD8 T細(xì)胞和抗腫瘤免疫反應(yīng)中的重要作用和機(jī)制。此外，本研究還提示DMF/PD-L1聯(lián)合抑制在腫瘤免疫治療中的潛力。
 
參考文獻(xiàn)
Yuying Jiang , Yongbing Yang, Yingchao Hu, et al. Gasdermin D restricts anti-tumor immunity during PD-L1 checkpoint blockade.Cell Reports. 2022 Oct 25;41(4):111553.