本文要點：腎臟纖維化在世界范圍內普遍存在，因此早期診斷具有重要意義。近紅外窗口光學成像已被公認為一種及時發(fā)現腎功能障礙的有吸引力的技術。然而，研制一種能夠早期監(jiān)測腎臟纖維化并同時可清除正常人群腎臟中的造影劑仍然具有挑戰(zhàn)性。本文精心設計了一種具有聚集誘導發(fā)射(AIE)特征的納米熒光團，即AIE- 4PEG550 NPs。適用于通過短波紅外(SWIR, 900-1700 nm)熒光和光聲雙峰成像對纖維化的早期進展縱向可視化。AIE-4PEG550 NPs體積小(約26 nm)，腎臟可過濾分子量為3.3 kDa，腎臟清除率高(24 h內通過腎臟排出93.1±1.7%)，出色的成像性能和良好的生物相容性，這些特點使AIE-4PEG550 NPs遠遠優(yōu)于臨床診斷測定。本研究的發(fā)現將為下一代診斷腎纖維化程度的試劑提供了藍圖。
 

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背景：慢性腎臟疾病(CKD)的流行極大地影響了全世界人民的健康。鑒于CKD發(fā)病率高、潛伏期大的特點，為防止情況惡化為嚴重的腎功能障礙，早期識別纖維化腎臟組織是必要的。截至目前，評估腎臟纖維化可通過腎臟活檢、計算機斷層掃描CT、正電子發(fā)射斷層掃描PET、磁共振成像MRI等，但這些方法可能面臨高出血風險、設備的不可及性，高輻射風險和含重金屬造影劑誘發(fā)的潛在腎毒性。因此，本文提出的AIE- 4PEG550 NPs以一種非侵入性的成像方式，高靈敏度的光學成像、優(yōu)越的空間和時間分辨率、多功能和各種成像劑的可及性對早期的腎臟纖維化進行實時診斷。

 

研究內容：分子設計和光物理性質研究：首先通過簡單的步驟得到目標熒光團AIE-4COOH，關鍵步驟有 4，4'-（苯基氮雜二酰基）二苯甲醛與化合物1之間的Wittig反應，4,7-二溴5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑(DPTQ)與中間體5之間的Suzuki偶聯(lián)反應。為了使生成的AIE-4COOH具有良好的水溶性，將羧基與0.55 kDa PEG-NH2進一步聚乙二醇化，通過簡單的縮合反應得到AIE-4PEG550。優(yōu)化的AIE-4COOH分子幾何結構表明，DPTQ核與相鄰苯環(huán)之間的二面角均為45°，表明分子幾何結構充塞，有助于抑制π-π的堆積。除了三苯胺單元中的三個立體擁擠苯環(huán)外，DPTQ核中還有兩個可自由旋轉的苯環(huán)，喹喔啉核與相鄰苯環(huán)之間二面角為39°(Figure.1A)。如Figure1B所示，最低未占據分子軌道的電子密度(LUMO，-3.05eV) 主要集中在缺電子的DPTQ核上，而最高占據分子軌道(HOMO， -4.87 eV)沿共軛骨架分布，表明分子內電荷轉移特性突出。AIE-4COOH的最大吸收峰在~ 630 nm處，發(fā)射峰在910 nm處(Figure.1C)。隨后使用不同水比例的DMSO/水體系對AIE特征進行了探索。如Figure1D所示，當水比逐漸增加到70%時，AIE-4COOH的亮度增強。AIE4PEG550在水中溶解良好，在645 nm處有一個吸收峰，摩爾吸收系數(ε)為5.8 × 104 M-1cm-1，在SWIR區(qū)有一個最大發(fā)射峰，尾延伸到第二近紅外窗口(NIR-II, 1000-1700 nm)(Figure.1E)。同時，AIE- 4peg550在DMSO/水混合物中也表現出良好的AIE特征，動態(tài)光散射(DLS)分析顯示，AIE-4PEG550 NPs的流體動力學直徑為26 nm，適合于腎臟清除(Figure.1F)。如Figure1G所示，AIE-4PEG550 NPs的熒光強度隨著濃度的增加而增加，在60 μM濃度下仍能保持較高的發(fā)射強度，這有利于染料在靶位點的積累。相反，市售吲哚菁綠(ICG)在濃度低于5 μM時發(fā)射量逐漸增加，高濃度時發(fā)射量急劇下降。此外，AIE-4PEG550 NPs表現出可接受的光穩(wěn)定性，因為在連續(xù)660 nm光照30分鐘后，監(jiān)測到的發(fā)射強度只有輕微下降。相反，經過相同處理后，ICG完全光漂白(Figure.1H)。
 

Figure 1

 

人類腎臟細胞的熒光成像: 隨后采用標準的CCK-8實驗評估了AIE-4PEG550 NPs對體外HK-2細胞的細胞毒性。如Figure.2A所示，NPs表現出良好的生物相容性，在0 ~ 100 μ g mL-1的材料存在下，存活率超過95%。培養(yǎng)24小時后，通過共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)和SWIR顯微鏡成像觀察AIE-4PEG550 NPs的細胞攝取，并用核特異性藍色熒光染料聯(lián)合染色驗證(Figure.2B)。如Figure.2C所示，60次循環(huán)掃描后，保留了80%的初始熒光強度，成像穩(wěn)定性良好。

Figure2

 

活體腎纖維化的光學成像: 我們將AIE-4PEG550 NPs靜脈給藥給正常C57BL/6小鼠(簡稱“正常”組)。如Figure.3A所示，AIE-4PEG550 NPs處理4 min后，使用900 nm長通濾波器，通過FLI在SWIR區(qū)域可見雙側腎臟的輪廓。值得注意的是，由于腎臟排泄效率極好，肝臟幾乎沒有信號。腎臟信號在注射后4min迅速上升至峰值，40min后逐漸消失。多次證實PAI結合了優(yōu)越的空間分辨率和深度穿透深度的優(yōu)點。如Figure.3B所示，在腎臟部位可見到較強的PA信號，與FLI所得結果一致。同時，膀胱內AIE-4PEG550 NPs產生的熒光信號和PA振幅隨著時間的推移不斷增加，在給藥后60 min達到最大值。然后，這些物質可以通過尿液從膀胱中徹底排出，避免潛在的毒性(Figure.3CD)。定量分析表明，注射后4 min和60 min，腎臟區(qū)域FLI/PAI強度分別比未注射的小鼠高1.63/4.8倍和1.08/1.04倍。膀胱的相應數據分別為1.89/4.78倍和4.69/16.4倍，說明AIE-4PEG550 NPs從腎臟向膀胱的排泄速度較快(Figure.3EF)。
 

Figure3

 

在確認其對正常腎臟小鼠的超快腎臟排泄能力后，作者進一步利用AIE-4PEG550研究其在葉酸誘導的腎病模型中的行為，這是一個完善的模型，發(fā)展為腎小管間質纖維化。與腎功能正常組形成鮮明對比，180min內熒光強度持續(xù)增強，表明AIE-4PEG550在腎臟內蓄積(Figure.4AB)。由于腎臟功能障礙，通過尿液排泄的代謝減慢，在180分鐘內，膀胱內的FL/PA強度明顯減弱，并以溫和的速度增長 (Figure.4DE)。直觀量化的變化表明，在20、60和180分鐘后FLI/PAI信號在指定腎臟區(qū)域分別比預處理小鼠增加2.26/1.5、2.78/5.5和4.06/10.0倍(Figure.4G)。平行比較三組腎臟的FL強度。如Figure.4H所示，“1周”組的FL強度在180 min內持續(xù)上升至4.07倍，與其他兩組形成了鮮明的對比。具體來說，正常組的FL信號與注射后40 min的背景信號相似。而“4周”組，給藥后FL信號維持在1.6倍左右。此外，腎臟-膀胱(Rktb)的FL強度比被評估為時間的函數，從中我們可以清楚地識別腎臟纖維化:Rktb > 1表示腎臟早期纖維化(Figure.4I)。

Figure4

 

與其他檢測方法比較：對腎組織進行H&E、Masson三色染色等組織學分析，定量評估間質纖維化面積，成功建立不同程度腎纖維化小鼠模型(Figure.5AB)。臨床評估腎功能障礙的診斷方法主要依賴血清肌酐(sCr)、血尿素氮(BUN)和腎小球濾過率(GFR)的監(jiān)測。從Figure5CE中可以看到，盡管“1周”組的sCr和BUN明顯比“正常”組增加了2.82倍和1.67倍，但“1周”組的GFRs僅下降了17.4%。值得注意的是，本文開發(fā)的診斷方案可以在早期清晰地區(qū)分進行性腎纖維化。主要器官的H&E染色顯示，AIE-4PEG550 NPs沒有誘導各種組織破壞，說明其具有良好的生物安全性(Figure.5F)。

Figure5

 

總結：本文合成了一種水溶性NIR發(fā)射熒光團，即AIE-4PEG550，該熒光團在正常小鼠體內表現出良好的光穩(wěn)定性和生物相容性，并具有極高的腎臟排泄效率(注射24 h后為93.1±1.7%)。此外，AIE-4PEG550 NPs同時開啟SWIR/NIR-II區(qū)FL信號和NIR-I區(qū)PA信號，可用于無創(chuàng)腎纖維化的實時雙模成像和鑒別。在正常和不同程度的腎纖維化小鼠體內注射AIE-4PEG550 NPs后，可通過腎臟和膀胱部位PL/PA信號強度的明顯變化實現縱向纖維化分期。與sCr、BUN和GFR等早期診斷腎功能障礙的臨床診斷方法相比，AIE-4PEG550 NPs在無創(chuàng)治療、腎臟清除效率高、生物相容性好等方面表現出明顯的優(yōu)勢，因此在臨床前腎纖維化檢測中具有很大的前景。

 

參考文獻

DOI: 10.1002/adma.202206643

 

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