動物活體成像的應(yīng)用：探究阿侖膦酸鹽鐵納米螯合劑可以有效治療腹膜癌
近日，中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院潘逸航副院長研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)阿侖膦酸鹽鐵納米螯合劑可以有效治療腹膜癌，相關(guān)研究成果已發(fā)表在國際知名期刊《ADVANCED SCIENCE》(IF=17.521，一區(qū)top期刊)上。
01 研究背景
鐵是各種細(xì)胞代謝的必要元素。癌細(xì)胞在其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中對鐵有很高的需求。阿侖膦酸鹽（ALN）是一種FDA批準(zhǔn)的具有金屬螯合能力的雙膦酸鹽，在本研究的理論和實(shí)驗(yàn)中，最初被證明可以選擇性地結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的Fe3+。
因此，研究中合理地設(shè)計(jì)了CaALN鐵納米螯合劑，通過耗鐵和鈣積累的協(xié)同作用來殺死癌細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)和RNA測序分析表明，CaALN納米藥物通過消耗Fe、干擾DNA復(fù)制、觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）來抑制癌細(xì)胞的增殖。同時，釋放的Ca2+和ROS相互促進(jìn)并誘導(dǎo)細(xì)胞大分子損傷，導(dǎo)致癌細(xì)胞線粒體凋亡。
在含有人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的腹腔內(nèi)播散性小鼠模型中，CaALN納米顆粒選擇性地在腫瘤組織中積累，并導(dǎo)致腫瘤生長和腹水形成的顯著遲緩。治療組中攜帶SKOV3的小鼠的平均生存時間從33天延長到90天。這些結(jié)果表明，阿侖膦酸鹽來源的鐵螯合劑可作為治療腹膜癌的有效策略。
02 研究方法
為評價CaLAN的體內(nèi)分布，通過腹腔注射5×106 SKOV3細(xì)胞至NOD/SCID小鼠體內(nèi)，建立腹腔內(nèi)播散性腫瘤異種移植模型。
值得注意的是，SKOV3細(xì)胞穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了攜帶熒光素酶（Luc）基因的慢病毒，該基因可表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物發(fā)光信號，并被動物活體成像系統(tǒng)捕獲。
為了實(shí)現(xiàn)體內(nèi)實(shí)時監(jiān)測，CaALN納米顆粒用DiR熒光標(biāo)記。如圖3 A第一行所示，腹腔內(nèi)可檢測到熒光素酶信號，提示腹腔內(nèi)異種移植小鼠模型成功建立。腫瘤建立14天后，通過腹腔注射CaALN/DiR或游離DiR來評價CaALN納米顆粒在小鼠體內(nèi)的分布。
腫瘤和器官的圖像和定量熒光強(qiáng)度證實(shí)了腹腔注射CaALN納米顆�？梢栽谧⑸�4h后靶向腫瘤組織（圖3 A，B）。在游離DiR組中，熒光不僅分布在腫瘤部位，而且還分布在肝臟和脾臟（圖3 C，D）。CaALN的腫瘤靶向優(yōu)勢可能歸因于腹膜-等離子體屏障的存在，它在腹膜腔內(nèi)保持了較高的區(qū)域的CaALN納米顆粒濃度，并最終被癌細(xì)胞吸收（圖3 E）。相比之下，小分子可以通過腹膜-血漿屏障進(jìn)入腹膜下毛細(xì)血管，并通過肝、脾進(jìn)行代謝（圖3 F）。
經(jīng)腹腔注射A）CaALN/DiR和C）游離DiR后SKOV3荷瘤小鼠生物發(fā)光和熒光信號隨時間變化的圖像
B、 D）在腹腔注射72小時后，從SKOV3荷瘤小鼠解剖的腫瘤（Tu）、肝臟（Li）、心臟（He）、脾臟（Sp）、肺（Lu）和腎臟（Ki）的體外生物發(fā)光和熒光圖像。
E） CaALN納米顆粒和小分子的體內(nèi)分布圖示。
F） 用CaALN/DiR和DiR處理的小鼠體外組織的熒光強(qiáng)度（平均值±SD，n=3，***P<0.001，**P<0.01）。
受其體外抗腫瘤活性和體內(nèi)腫瘤靶向能力的影響，作者進(jìn)一步評價了CaALN納米顆粒的體內(nèi)腫瘤抑制活性。腫瘤細(xì)胞移植5天后，攜帶SKOV3的小鼠分別用PBS和兩種不同劑量的CaALN（10和25mg/kg，n=8）處理。對其中5只小鼠進(jìn)行定期成像并通過收集體重、腹圍和生存數(shù)據(jù)進(jìn)行監(jiān)測。（圖4 A）。
如圖4 B，C所示，兩種劑量的CaALN處理組的生物發(fā)光維持了15天，這意味著完全抑制了腫瘤的生長。
A） 使用SKOV3腹腔異種移植模型的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的示意圖。
B） 生物發(fā)光圖像，C）生物發(fā)光強(qiáng)度，D）體重，E）腹圍，F）每個治療組中SKOV3荷瘤小鼠的生存曲線。
G） 第31天的代表性腫瘤切片的H&E染色圖像和隧道組織化學(xué)圖像。
04 總結(jié)
在人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的腹腔內(nèi)播散性小鼠模型中已經(jīng)證明，CaALN納米顆粒腹腔注射給藥主要積累在腫瘤組織中。此外，CaALN納米顆粒治療不僅降低了腫瘤負(fù)荷，而且抑制了腹水的形成，在卵巢癌的治療中具有相當(dāng)大的臨床應(yīng)用價值。本研究已經(jīng)證明了一種獨(dú)特的策略，使用阿侖膦酸鈉形成的鐵納米螯合劑，可以提高治療效力和減少小分子的副作用，以有效地治療腹膜癌。
△ 圖1國際知名期刊《ADVANCED SCIENCE》
01 研究背景
鐵是各種細(xì)胞代謝的必要元素。癌細(xì)胞在其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中對鐵有很高的需求。阿侖膦酸鹽（ALN）是一種FDA批準(zhǔn)的具有金屬螯合能力的雙膦酸鹽，在本研究的理論和實(shí)驗(yàn)中，最初被證明可以選擇性地結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的Fe3+。
因此，研究中合理地設(shè)計(jì)了CaALN鐵納米螯合劑，通過耗鐵和鈣積累的協(xié)同作用來殺死癌細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)和RNA測序分析表明，CaALN納米藥物通過消耗Fe、干擾DNA復(fù)制、觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）來抑制癌細(xì)胞的增殖。同時，釋放的Ca2+和ROS相互促進(jìn)并誘導(dǎo)細(xì)胞大分子損傷，導(dǎo)致癌細(xì)胞線粒體凋亡。
在含有人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的腹腔內(nèi)播散性小鼠模型中，CaALN納米顆粒選擇性地在腫瘤組織中積累，并導(dǎo)致腫瘤生長和腹水形成的顯著遲緩。治療組中攜帶SKOV3的小鼠的平均生存時間從33天延長到90天。這些結(jié)果表明，阿侖膦酸鹽來源的鐵螯合劑可作為治療腹膜癌的有效策略。
02 研究方法
為評價CaLAN的體內(nèi)分布，通過腹腔注射5×106 SKOV3細(xì)胞至NOD/SCID小鼠體內(nèi)，建立腹腔內(nèi)播散性腫瘤異種移植模型。
值得注意的是，SKOV3細(xì)胞穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了攜帶熒光素酶（Luc）基因的慢病毒，該基因可表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物發(fā)光信號，并被動物活體成像系統(tǒng)捕獲。
△ 圖2實(shí)驗(yàn)中動物體內(nèi)成像使用了博鷺騰AniView系列多模式動物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝。
為了實(shí)現(xiàn)體內(nèi)實(shí)時監(jiān)測，CaALN納米顆粒用DiR熒光標(biāo)記。如圖3 A第一行所示，腹腔內(nèi)可檢測到熒光素酶信號，提示腹腔內(nèi)異種移植小鼠模型成功建立。腫瘤建立14天后，通過腹腔注射CaALN/DiR或游離DiR來評價CaALN納米顆粒在小鼠體內(nèi)的分布。
腫瘤和器官的圖像和定量熒光強(qiáng)度證實(shí)了腹腔注射CaALN納米顆�？梢栽谧⑸�4h后靶向腫瘤組織（圖3 A，B）。在游離DiR組中，熒光不僅分布在腫瘤部位，而且還分布在肝臟和脾臟（圖3 C，D）。CaALN的腫瘤靶向優(yōu)勢可能歸因于腹膜-等離子體屏障的存在，它在腹膜腔內(nèi)保持了較高的區(qū)域的CaALN納米顆粒濃度，并最終被癌細(xì)胞吸收（圖3 E）。相比之下，小分子可以通過腹膜-血漿屏障進(jìn)入腹膜下毛細(xì)血管，并通過肝、脾進(jìn)行代謝（圖3 F）。
△ 圖3CaALN的體內(nèi)生物分布。
腹腔注射后SKOV3荷瘤小鼠體內(nèi)時間依賴性生物發(fā)光和熒光圖像。經(jīng)腹腔注射A）CaALN/DiR和C）游離DiR后SKOV3荷瘤小鼠生物發(fā)光和熒光信號隨時間變化的圖像
B、 D）在腹腔注射72小時后，從SKOV3荷瘤小鼠解剖的腫瘤（Tu）、肝臟（Li）、心臟（He）、脾臟（Sp）、肺（Lu）和腎臟（Ki）的體外生物發(fā)光和熒光圖像。
E） CaALN納米顆粒和小分子的體內(nèi)分布圖示。
F） 用CaALN/DiR和DiR處理的小鼠體外組織的熒光強(qiáng)度（平均值±SD，n=3，***P<0.001，**P<0.01）。
受其體外抗腫瘤活性和體內(nèi)腫瘤靶向能力的影響，作者進(jìn)一步評價了CaALN納米顆粒的體內(nèi)腫瘤抑制活性。腫瘤細(xì)胞移植5天后，攜帶SKOV3的小鼠分別用PBS和兩種不同劑量的CaALN（10和25mg/kg，n=8）處理。對其中5只小鼠進(jìn)行定期成像并通過收集體重、腹圍和生存數(shù)據(jù)進(jìn)行監(jiān)測。（圖4 A）。
如圖4 B，C所示，兩種劑量的CaALN處理組的生物發(fā)光維持了15天，這意味著完全抑制了腫瘤的生長。
△ 圖4
CaALN對SKOV3小鼠的體內(nèi)抗腫瘤作用。A） 使用SKOV3腹腔異種移植模型的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的示意圖。
B） 生物發(fā)光圖像，C）生物發(fā)光強(qiáng)度，D）體重，E）腹圍，F）每個治療組中SKOV3荷瘤小鼠的生存曲線。
G） 第31天的代表性腫瘤切片的H&E染色圖像和隧道組織化學(xué)圖像。
04 總結(jié)
在人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的腹腔內(nèi)播散性小鼠模型中已經(jīng)證明，CaALN納米顆粒腹腔注射給藥主要積累在腫瘤組織中。此外，CaALN納米顆粒治療不僅降低了腫瘤負(fù)荷，而且抑制了腹水的形成，在卵巢癌的治療中具有相當(dāng)大的臨床應(yīng)用價值。本研究已經(jīng)證明了一種獨(dú)特的策略，使用阿侖膦酸鈉形成的鐵納米螯合劑，可以提高治療效力和減少小分子的副作用，以有效地治療腹膜癌。
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