于曉潔

博士研究生

北京大學

鄧宏魁課題組

在本研究的初期，我們使用傳統(tǒng)Western Blot技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄因子的檢測，但是由于我們研究的轉(zhuǎn)錄因子定位于細胞核且豐度不高，如果提取總蛋白就會大大削弱目標蛋白的水平，而傳統(tǒng)WB往往對于蛋白的需求量較高，導致我們檢測不到樣本中的轉(zhuǎn)錄因子表達，浪費了許多時間和金錢成本。后來，偶然間得知北京大學國家蛋白質(zhì)中心平臺有一臺ProteinSimple的全自動Digital WB，可以實現(xiàn)微量蛋白的檢測，因此我們開始嘗試使用Wes來檢測我們的目標轉(zhuǎn)錄因子。

Wang, Yuting et al. Unveiling E2F4, TEAD1 and AP-1 as regulatory transcription factors of the replicative senescence program by multi-omics analysis. Protein & Cell (IF: 14.87), 2022.

細胞衰老，影響多種生理和病理過程，對整個機體衰老尤為重要。目前研究領域中發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子能夠影響衰老表征，但是仍缺乏通過多組學系統(tǒng)性分析傳代衰老過程的表觀變化。因此，本研究通過分析傳代衰老過程中細胞轉(zhuǎn)錄組、甲基化組以及染色體可及性的時序性變化過程，發(fā)現(xiàn)炎癥信號的上調(diào)以及增殖能力的下降是傳代衰老過程的主要特征。進一步整合分析以及利用遺傳學手段，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子E2F4、TEAD1和AP1是傳代衰老過程重要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。過表達E2F4能夠提高衰老細胞的增殖潛力，改善細胞衰老β-半乳糖苷酶活性并且改變衰老相關(guān)的甲基化位點。敲低TEA D1同樣能夠改善細胞衰老β-半乳糖苷酶活性并且改變部分衰老的轉(zhuǎn)錄譜學特征。另外，敲低ATF3，作為AP1家族轉(zhuǎn)錄因子的核心成員，能夠降低衰老細胞cdkn2a(p16)的基因表達。綜上所述，本研究結(jié)果通過多組學分析確定了調(diào)控衰老程序的轉(zhuǎn)錄因子，為抗衰老提供了潛在的治療靶點。

在本研究中，我們使用了ProteinSimple的全自動Digital Western Blot（也稱Simple Western）進行蛋白免疫印跡實驗。本研究中利用Wes（Digital WB型號之一）對過表達及敲低的基因進行蛋白水平的檢測，由于轉(zhuǎn)錄因子是需要表達出蛋白發(fā)揮作用，因此通過遺傳學手段操控轉(zhuǎn)錄因子除了檢測mRNA水平，蛋白水平的檢測也是必不可少。通過Wes檢測，可以清楚的說明我們確實過表達及敲低了目標轉(zhuǎn)錄因子，從而驗證了我們的假設。

在本研究的初期，我們使用傳統(tǒng)Western Blot技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄因子的檢測，但是由于我們研究的轉(zhuǎn)錄因子定位于細胞核且豐度不高，如果提取總蛋白就會大大削弱目標蛋白的水平，而傳統(tǒng)WB往往對于蛋白的需求量較高，導致我們檢測不到樣本中的轉(zhuǎn)錄因子表達，浪費了許多時間和金錢成本。

后來我們也嘗試了分離提取核蛋白，但是可能是由于提取過程的損耗，得到的核蛋白量也很低，達不到傳統(tǒng)WB的需求量（10-15ug以上），因此在前期也是繞了很多彎路。后來，偶然間得知北京大學國家蛋白質(zhì)中心平臺有一臺ProteinSimple的全自動Digital WB，可以實現(xiàn)微量蛋白的檢測，因此我們開始嘗試使用Wes來檢測我們的目標轉(zhuǎn)錄因子。在技術(shù)支持的幫助下，我們在僅使用總蛋白（即無需提純核蛋白）的基礎上檢測到了目標轉(zhuǎn)錄因子，也清晰展現(xiàn)出了我們想要的結(jié)果，即過表達或者敲低目標轉(zhuǎn)錄因子對應的表達量升高或降低。在這里，也非常感謝北大國家蛋白質(zhì)中心平臺提供了ProteinSimple的Digital WB儀器，為我們解決了研究過程遇到的難題。

未來，我們還是期望致力于衰老及再生醫(yī)學領域。目前人口老齡化是全世界共同面對的問題，但是領域內(nèi)大家對于衰老的認識還在積累中，因此從基礎研究到未來的臨床轉(zhuǎn)化還有一段很長的路要走。我們希望通過基礎研究積極為認識衰老以及對抗衰老做出一些微薄之力，以期望早日實現(xiàn)全民健康衰老。

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