什么技術(shù)能被RNA藥物領(lǐng)域領(lǐng)導(dǎo)者廣泛采用?
如mRNA藥物領(lǐng)域Moderna、BioNtech和CureVac等;ASO領(lǐng)域中Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等;siRNA領(lǐng)域Alnylam、Dicerna和Arrowhead等;saRNA領(lǐng)域MiNA Therapeutics和中美瑞康等,及其他RNA療法公司。
隨著mRNA新冠疫苗成功,RNA藥物進入了快速發(fā)展階段。在全球范圍內(nèi),RNA療法為各國研究人員擴大藥物開發(fā)靶點范圍提供了獨特機會,其作用靶點的多樣性引起了領(lǐng)先的科研機構(gòu)、新興生物技術(shù)公司和大制藥公司極大關(guān)注。
目前有多不同類型RNA療法在研發(fā)過程中,主要包括反義寡核苷酸(ASO)、小干擾核酸(siRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)、Aptamer(核酸適配體)等等。
作為一類新的藥物治療形態(tài),可對常規(guī)藥物分子無法靶向的蛋白質(zhì)和基因進行選擇性作用,RNA核酸藥物已經(jīng)在多種疾病中應(yīng)用。
盡管RNA療法研發(fā)取得了非凡的進步,還有很多問題和挑戰(zhàn)需要克服,如RNA高度不穩(wěn)定、體內(nèi)遞送效率低、宿主細胞免疫原性等。RNA分子以藥物或靶向RNA小分子形式直接用于治療兩種模式。RNA藥物可利用內(nèi)源性調(diào)節(jié)機制,并可特異性調(diào)節(jié)目標靶點。RNA藥物須通過細胞膜并具有結(jié)合細胞內(nèi)靶標能力,并調(diào)控基因表達,進而實現(xiàn)相關(guān)蛋白質(zhì)表達調(diào)節(jié)。
RNA療法基本原理
蛋白質(zhì)表達水平檢測是藥理藥效研究非常重要的方面,目前有多種技術(shù)可以實現(xiàn)不同基質(zhì)中分泌型和內(nèi)源性蛋白質(zhì)定量分析,例如ELISA技術(shù),LC-MS技術(shù)、Western Blot技術(shù)等,也有一些創(chuàng)新性技術(shù)逐步被主流核酸藥物公司所采用,本文將介紹核酸藥物領(lǐng)導(dǎo)者采用什么技術(shù)解決研發(fā)中蛋白質(zhì)分析問題。
案例1:Moderna--臨床前動物模型中蛋白質(zhì)表達定量技術(shù)
Moderna公司目前在研臨床I期mRNA療法,mRNA-3927用于治療丙酸血癥(Propionic acidemia,PA)。
臨床前小鼠動物模型研究表明,雙RNA療法可恢復(fù)代謝功能。丙酸血癥是一種線粒體酶丙酰輔酶A羧化酶(PCC)缺乏引起固有代謝紊亂,PCC由六個α(PCCA)和六個β(PCCB)亞基組成。采用編碼人類PCCA和PCCB的雙mRNA組合,裝載在可生物降解脂質(zhì)納米顆粒(LNP)中,在肝臟中可產(chǎn)生功能性PCC酶。
雙mRNA編碼的蛋白質(zhì)比單獨mRNA具有更高PCC酶活性。下圖a-c是比較雙RNA共轉(zhuǎn)染與hPCCA或hPCCB mRNA單獨轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)。a和d圖是酶活性評估,b和c圖是采用毛細管Digital Western定量檢測患者成纖維細胞中PCCA和PCCB蛋白質(zhì)表達。
案例2:Arcturus Therapeutics--組織中定量檢測hOTC表達
Arcturus Therapeutics公司臨床階段mRNA療法ARCT-810用于治療鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶缺乏癥 (Ornithine Transcarbamylase Deficiency, OTCD)。該疾病是尿素循環(huán)障礙中最常見的一種遺傳性代謝病,OTC基因突變會導(dǎo)致高氨血癥發(fā)作。
脂質(zhì)納米顆粒(LNP)裝載的OTC mRNA(LUNAR-OTC mRNA)利用專有的脂質(zhì)藥物介導(dǎo)技術(shù),可安全高效地將OTC mRNA遞送到肝細胞內(nèi),使患者自身肝細胞內(nèi)能自然產(chǎn)生功能正常的OCT酶。進而,臨床前小鼠模型研究中,通過測量OTC-mRNA藥物處理后小鼠肝臟和血漿中OTC酶活性和蛋白質(zhì)表達,來反映LUNAR-OTC mRNA藥物在小鼠模型中藥效。
人鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶 (hOTC) 在小鼠肝臟中蛋白表達。使用全自動毛細管Digital Western(Jess, Simple Western)系統(tǒng)定量檢測小鼠肝臟中hOTC 蛋白表達,以重組蛋白為校正曲線來進行定量。使用抗人OTC抗體,從四個遞增劑量組觀察到明顯的劑量反應(yīng),在未治療OTC缺陷組或未治療野生型組中未檢測到hOTC蛋白。OTC蛋白表達水平與肝臟樣本中OTC活性有很好的相關(guān)性。
案例3:Ionis Pharmaceuticals--ASO抑制RBM20可改善心力衰竭功能
射血分數(shù)(測量每次心臟收縮時離開心臟的血液百分比)保留的心力衰竭(HFpEF)是普遍和致命的。目前為止,沒有很好的靶向治療藥物。病因之一是心室充盈受損,德國馬克斯-德爾布呂克分子醫(yī)學(xué)中心和Ionis Pharmaceuticals科學(xué)家使用靶向心臟剪接因子RBM20的反義寡核苷酸(ASO)可改善其功能。
在比剛度增加的成年小鼠中,2個月內(nèi)每周給ASO可增加順應(yīng)性肌動蛋白異構(gòu)體表達,并改善心臟功能。人類工程心臟組織中驗證結(jié)果顯示,在ASO治療3周內(nèi)RBM20表達下調(diào)至不到50%,導(dǎo)致沒有心臟病理狀況下適應(yīng)性松弛動力學(xué)。本研究表明,抗RBM20 ASO可作為強大的心臟剪接調(diào)節(jié)劑,治療人類HFpEF。
注射RBM20 ASO有效抑制小鼠心臟RBM20表達。(B)圖是小鼠體內(nèi)實驗設(shè)計,(C)用PBS或ASO處理的野生型(WT)和N2B敲除 (KO) 小鼠心臟組織中的Rbm20 mRNA表達,(D和E)采用全自動毛細管Digital Western檢測相應(yīng)的RBM20蛋白表達豐度。mRNA和蛋白表達分子水平上,RBM20表達豐度下調(diào)50%以上。
全自動毛細管Digital Western技術(shù)是核酸藥物研發(fā)中蛋白質(zhì)表達定量先進工具
以上Moderna、Arcturus Therapeutics和Ionis Pharmaceuticals三個案例是Digital Western代表案例,此技術(shù)已經(jīng)廣泛被RNA藥物領(lǐng)域領(lǐng)導(dǎo)者采用。如mRNA藥物領(lǐng)域的Moderna、BioNtech和CureVac等,ASO方面Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等,siRNA領(lǐng)域Alnylam、Dicerna和Arrowhead等,saRNA領(lǐng)域MiNA Therapeutics和中美瑞康等采用,及其他RNA療法公司。
全自動毛細管Digital Western技術(shù)作為創(chuàng)新性毛細管電泳免疫學(xué)技術(shù),將Western Blot技術(shù)和ELISA技術(shù)合二為一,可利用微量組織樣本實現(xiàn)內(nèi)源性蛋白質(zhì)精準的相對定量和絕對定量。作為創(chuàng)新型生物分析方法,其具備傳統(tǒng)Western Blot蛋白質(zhì)分子量可視化優(yōu)勢,定性更準確,同時具備ELISA和MS技術(shù)精準定量性能,其靈敏度和精密度符合高標準生物分析要求。
針對RNA療法應(yīng)用的技術(shù)優(yōu)勢
1) Digital Western技術(shù)適合RNA療法體外和體內(nèi)各種模型中靶蛋白表達定量分析,用于細胞系、類器官模型、小鼠動物模型和非人靈長類動物模型的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分析;
2) Digital Western技術(shù)樣本量需求是傳統(tǒng)Western Blot幾十分之一,只需要3μL樣本就可實現(xiàn)多重蛋白質(zhì)表達檢測,特別適合微量珍貴樣本蛋白質(zhì)分析;
3) Digital Western精準定量檢測,傳統(tǒng)Western Blot只能滿足樣本半定量需求,重復(fù)性比較差。RNA療法某些靶蛋白表達與臨床治療效果相關(guān)聯(lián),可作為替代生物標志物,建立量效關(guān)系。要求靶蛋白分析檢測標準需要提高,要求技術(shù)需要經(jīng)過嚴格驗證,Digital Western可滿足這些需求;
4) 符合RNA療法對自動化標準化和效率的需求,面對行業(yè)激烈競爭,需要提升研發(fā)效率。Digital Western實現(xiàn)了全自動化和標準化,軟件符合FDA 21 CFR Part 11合規(guī)性需求。系統(tǒng)3個小時完成一批次蛋白質(zhì)分析,比傳統(tǒng)Western Blot和ELISA更快,大大提高了實驗效率,同時減少人力成本。
Jess全自動數(shù)字化蛋白質(zhì)表達定量分析系統(tǒng) (Digital Western) 是Bio-Techne集團旗下蛋白質(zhì)分析品牌ProteinSimple所有。系統(tǒng)利用毛細管電泳免疫學(xué)分析技術(shù),可從微量樣品中自動吸取、分離、捕獲蛋白質(zhì),并通過化學(xué)發(fā)光或熒光檢測目的蛋白含量。Digital WB自動化程度高,重復(fù)性好,靈敏度高和具有較寬動態(tài)檢測范圍,這些特點滿足基因治療項目不同階段的目的蛋白定量需求。
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