目前蛋白降解劑研發(fā)中PROTAC和分子膠臨床進(jìn)展領(lǐng)先，作用機(jī)制相對(duì)明確。PROTAC作用機(jī)制是“事件驅(qū)動(dòng)”的催化反應(yīng)，催化靶蛋白降解后，即可釋放出來(lái)參與下一個(gè)蛋白的降解。與傳統(tǒng)小分子抑制劑相比，可大幅降低給藥濃度。PROTAC即使經(jīng)過(guò)藥物代謝在體內(nèi)清除，細(xì)胞仍需要較長(zhǎng)時(shí)間將靶蛋白恢復(fù)到發(fā)揮生理作用水平，所以PROTAC有望延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間。

 

GSK公司臨床前研究初步展示，一款靶向RIPK2的PROTAC， 血藥濃度降到很低時(shí)，體內(nèi)RIPK2蛋白濃度仍維持在較低水平，炎癥因子維持較高抑制水平，這可能實(shí)現(xiàn)低頻次給藥。同時(shí)，PROTAC在藥物濃度優(yōu)化有“hook effect”。這些因素都導(dǎo)致傳統(tǒng)方法不能準(zhǔn)確評(píng)估PROTAC的PK/PD特性，需建立新的PK/PD評(píng)估系統(tǒng)。

 

建立新PK/PD評(píng)估系統(tǒng)需要檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確定量藥物濃度和蛋白質(zhì)降解水平關(guān)系，及相關(guān)生物標(biāo)志物變化，從而建立PK/PD作用關(guān)系。

 

 

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕闲枰�更多研究和設(shè)計(jì)，在固定給藥時(shí)間后取樣檢測(cè)藥物濃度變化與活性關(guān)系，動(dòng)物水平藥物作用后相關(guān)信號(hào)通路蛋白調(diào)節(jié)、還有生物標(biāo)志物選擇和檢測(cè)，要求要有可靠方法檢測(cè)動(dòng)物模型的內(nèi)源性蛋白表達(dá)。

 

目前有多種蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè)方法可用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床組織樣本研究。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，可特異性高靈敏檢測(cè)組織樣本中蛋白質(zhì)，用于臨床前和臨床樣本，但其缺點(diǎn)是樣本前處理復(fù)雜，樣本需求量大。流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜蛋白，特別是細(xì)胞膜蛋白，對(duì)血液中免疫細(xì)胞檢測(cè)有優(yōu)勢(shì)，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)和蛋白定量。免疫組化或免疫熒光技術(shù)，主要用于組織蛋白定位和半定量。ELISA技術(shù)主要用于檢測(cè)分泌型細(xì)胞因子和趨化因子。Western blot技術(shù)可視化看到靶蛋白降解，但傳統(tǒng)western只能半定量，手動(dòng)操作多，重復(fù)性差，時(shí)間長(zhǎng)，樣本需要量大，不能很好滿(mǎn)足PROTAC體內(nèi)精確蛋白定量需求。Digital Western作為一種新型的毛細(xì)管電泳免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，可滿(mǎn)足臨床前到臨床樣本檢測(cè)需求，實(shí)現(xiàn)從臨床前到臨床方法轉(zhuǎn)移，是新一代蛋白質(zhì)表達(dá)標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)。

 

 

行業(yè)領(lǐng)先公司采用Digital Western Blot（也稱(chēng)為Simple Western系統(tǒng)）案例分析

 

1.  輝瑞公司利用Digital WB分析PROTAC大鼠體內(nèi)降解組織選擇性

 

輝瑞公司發(fā)表在PNAS上文章，主要研究不同linker長(zhǎng)度對(duì)蛋白降解活性和組織選擇性的影響。

 

 

• 10只大鼠分5組皮下給藥PROTAC 10，藥物濃度遞增；175mg/kg兩次給藥。脾臟和肺臟內(nèi)BTK蛋白濃度變化。B圖是原始數(shù)據(jù)，絕對(duì)化學(xué)發(fā)光數(shù)據(jù)值變化。

• 盡管不同濃度化合物具有相似組織吸收度和和血漿利用度(D和E), PROTAC 10對(duì)大鼠脾臟細(xì)胞BTK具有濃度依賴(lài)性降解，但對(duì)于臟沒(méi)有，顯示出化合物組織選擇性；采用質(zhì)譜蛋白質(zhì)組量化脾臟和肺中BTK豐度獲得相似結(jié)果。

• 組織選擇性機(jī)制可能與BTK或E3連接酶表達(dá)、泛素化過(guò)程。研究體內(nèi)控制蛋白降解因素，需要深入理解PK/PD關(guān)系。

• 本研究展示開(kāi)發(fā)一種Digital WB技術(shù)檢測(cè)BTK靶蛋白表達(dá)方法，可用于細(xì)胞系和動(dòng)物組織樣本靶蛋白檢測(cè)，適用于In vitro到In vivo不同階段實(shí)驗(yàn)需求，方法通用性高。

 

2.  Digital Western開(kāi)發(fā)多發(fā)性骨髓瘤臨床樣本中蛋白質(zhì)表達(dá)評(píng)估，檢測(cè)63名患者10多種蛋白表達(dá)，包括CRBN和IKZF1蛋白表達(dá)，分析蛋白質(zhì)標(biāo)志物在多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后影響，作為預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物價(jià)值。

 

3.   Arvinas中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病Tau-PROTAC體內(nèi)研究案例

 

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是PROTAC研究的主要領(lǐng)域，具有多個(gè)研發(fā)管線(xiàn)在進(jìn)行。目前神經(jīng)疾病體內(nèi)實(shí)驗(yàn)經(jīng)常需要測(cè)試腦組織樣本，樣本具有珍稀特性，以Tau為例，具有多種翻譯后修飾，特別是各種磷酸化修飾，導(dǎo)致采用傳統(tǒng)Western blot技術(shù)具有多個(gè)條帶，實(shí)驗(yàn)條件復(fù)雜，很難準(zhǔn)確定量，在組織水平檢測(cè)這些致病蛋白具有更高的挑戰(zhàn)。

 

 

Arvinas公司建立了針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病一體化研發(fā)平臺(tái)，基于現(xiàn)有致病蛋白研究成果，構(gòu)建了早期發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，利用DEL、AI技術(shù)和對(duì)E3連接酶理解，開(kāi)發(fā)PROTAC分子。構(gòu)建了PK/PD體內(nèi)研究模型，來(lái)支持臨床轉(zhuǎn)化開(kāi)發(fā)。其Tau-PROTAC項(xiàng)目可區(qū)分健康和病理Tau蛋白，具有技術(shù)優(yōu)勢(shì)。而抗體藥物只能阻斷細(xì)胞外病理Tau，ASO等基因編輯技術(shù)，不能區(qū)分健康和病理狀態(tài)Tau蛋白。本項(xiàng)目預(yù)期2022年可能臨床獲批IND。本項(xiàng)目利用Digital Western檢測(cè)體外細(xì)胞水平不溶性Tau蛋白降解水平，同時(shí)也檢測(cè)體內(nèi)PD/PD實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不溶性Tau降解水平。

 

 

4.  急性髓系白血病（AML）臨床試驗(yàn)樣本磷酸化蛋白定量分析

 

Onvansertib濃度依賴(lài)性降低pTCTP表達(dá)，在血漿中有抑制活性。部分病人中觀察到在循環(huán)異常細(xì)胞PLK1靶標(biāo)TCTP參與。骨髓異常細(xì)胞減少與PLK1靶標(biāo)TCTP參與相關(guān)，可能作為療效評(píng)估的生物標(biāo)志物。Digital WB技術(shù)滿(mǎn)足小分子藥物臨床樣本檢測(cè)需求，采用洗脫重雜交Replex技術(shù)，或者高靈敏雙色熒光Western可評(píng)估磷酸化蛋白表達(dá)，用于PD實(shí)驗(yàn)和生物標(biāo)志物檢測(cè)。

 

A和B是患者血漿樣本與HL-60細(xì)胞共孵育，進(jìn)行血漿抑制活性實(shí)驗(yàn)。Digital WB定量分析血漿樣本中pTCTP水平變化；

B圖不同Onvansertib藥物濃度下pTCTP抑制水平。高濃度時(shí)抑制水平增加；

C圖是病人PBMC樣本TCTP和磷酸化TCTP蛋白表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。第一天給藥前后0h和3h結(jié)果，上面target engagement病人（ ≥50% pTCTP 抑制 ），下面是nontarget engagement病人。12，27和40三個(gè)劑量不同患者數(shù)據(jù)；

D圖是骨髓異常細(xì)胞群相對(duì)于基線(xiàn)的百分比變化瀑布圖。

 

Digital Western技術(shù)

在PROTAC體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)價(jià)值

 

檢測(cè)微量珍貴動(dòng)物組織樣本如腦組織或肌肉組織等，實(shí)現(xiàn)靶蛋白和細(xì)胞信號(hào)通路蛋白質(zhì)標(biāo)志物定量檢測(cè)。將在體內(nèi)PD/PK和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮重要作用，加快藥物研發(fā)。

自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)化：Digital Western快速獲得高質(zhì)量重復(fù)性數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)合規(guī)，軟件符合FDA CFR Part 11要求，可滿(mǎn)足臨床實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求。已被用于小分子藥物臨床實(shí)驗(yàn)和基因治療臨床試驗(yàn)中蛋白質(zhì)標(biāo)志物檢測(cè)。

技術(shù)適用于藥物研發(fā)臨床前和臨床不同階段檢測(cè)需求，開(kāi)發(fā)一種方法滿(mǎn)足不同場(chǎng)景下生物分析需求，從藥物發(fā)現(xiàn)階段In vitro細(xì)胞水平系實(shí)驗(yàn)、到動(dòng)物體內(nèi)PK/PD實(shí)驗(yàn)、Ex Vivo實(shí)驗(yàn)，一直到藥物臨床試驗(yàn)中病人活檢組織樣本。

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參考文獻(xiàn)

1. Mares, A., Miah, A.H., Smith, I.E.D. et al. Extended pharmacodynamic responses observed upon PROTAC-mediated degradation of RIPK2. Commun Biol 3, 140 (2020).

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3. Derek W. Bartlett and Adam M. Gilbert. Translational PK–PD for targeted protein degradation.Chem. Soc. Rev., 2022,51, 3477

4. Adelajda Zorba, etc. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. PNAS, July 16.2018

5. https://s3.us-east-1.amazonaws.com/arvinas-assets.investeddigital.com/scientific-publications/Angela-Cacace-AAIC-July-2021_2021-08-06-014821_rskj.pdf