本文要點：在肺癌手術中，腫瘤邊界的確定和切緣距離的確定是非常重要的。在以往的研究中，系統(tǒng)應用熒光探針可以幫助醫(yī)療人員確定腫瘤邊界，發(fā)現(xiàn)小腫瘤和轉移灶，從而提高手術切除的準確性。本文開發(fā)了一種新的技術，可以在手術中快速識別切除肺組織中的腫瘤區(qū)域，區(qū)分腫瘤邊界和轉移淋巴結。

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實驗設計：在動物實驗中，建立了肺癌的PDX模型。手術切除荷瘤小鼠的腫瘤、肺和瘤周肌肉組織，用靶向表皮生長因子受體(EGFR)探針孵育20分鐘，然后用封閉場近紅外II區(qū)(NIR-II)熒光成像系統(tǒng)成像。臨床標本為10例根治肺癌患者手術切除的10個肺組織和60個淋巴結，術中切除后立即用靶向探針進行培養(yǎng)并成像，以識別腫瘤區(qū)域，區(qū)分腫瘤邊界和轉移淋巴結。HE染色和免疫組化證實了熒光成像的準確性。

 

結果：體外動物成像實驗顯示腫瘤組織熒光增強。對于臨床樣本，本文的結果表明，這種新技術在識別切除肺組織中的腫瘤區(qū)域時具有超過85.7%的敏感性和100%的特異性。腫瘤與背景的平均熒光比為2.5±1.3。此外，本文還將該技術應用于術中轉移性淋巴結成像，發(fā)現(xiàn)轉移性淋巴結的熒光比正常淋巴結更亮，腫瘤與背景的平均熒光信號比為2.7±1.1。計算熒光信號與轉移淋巴結數(shù)量的關系，靈敏度為77.8%，特異性為92.1%。這項新技術有望成為快速術中病理檢測和切緣確定的有用診斷工具。

 

總結：利用熒光標記的抗人EGFR重組抗體scFv片段在手術中孵育新分離的組織，探針可快速積累在肺癌組織中，可用于快速識別切除肺組織中的腫瘤區(qū)域，區(qū)分腫瘤邊界和淋巴結內(nèi)的轉移灶。該技術有望用于術中快速病理檢測和切緣測定。

 

背景：肺癌是男性和女性最常見的癌癥之一，是對人群健康和生命構成嚴重威脅的惡性腫瘤。手術切除腫瘤是目前肺癌治療的主要方法之一，因此提高手術切除的準確性對降低肺癌死亡率至關重要。手術前，借助磁共振成像(MRI)和計算機斷層掃描（CT）或PET-CT成像來確定位置和肺癌的大小。然而，在手術過程中，很難確定被切除的組織是否是腫瘤以及手術邊緣是否殘留有腫瘤細胞。先前的研究表明，術中熒光成像可作為外科醫(yī)生進行腫瘤切除手術的實用輔助工具。熒光探針的臨床應用主要包括全身應用和局部應用兩大類。全身應用是指直接將熒光探針引入體內(nèi)，如ICG和OLT-38。局部應用是指將熒光探針局部噴涂、涂抹到腫瘤區(qū)域的方法。該方法操作簡單，不良反應率低。然而，與肺癌相關的局部應用研究鮮有報道。

 

術中病理診斷是在有限時間內(nèi)進行術中決策的必要條件；診斷結果使醫(yī)務人員能夠制定進一步的手術計劃。術中冷凍切片(IFS)技術因其準確、可靠、可降低再手術率等優(yōu)點被廣泛應用于術中病理診斷。然而，IFS也存在一些缺點，如對冷凍切片樣品的質(zhì)量要求非常高。在以往的研究中，熒光成像被用于輔助病理標本的選擇。在全身注射靶向熒光劑后，可以對手術標本進行非侵入性成像，客觀地確定腫瘤位于離標本深表面最近的位置，然后外科醫(yī)生可以利用這一信息立即切除額外的組織或?qū)⒖梢蓞^(qū)域的組織樣本送往IFS進行進一步評估。受此研究啟發(fā)，作者認為局部應用靶向熒光探針實現(xiàn)術中有效病理診斷可能更有吸引力，因為這種方法操作簡單，不良反應率較低。

 

本文提出了一種新的方法來實現(xiàn)腫瘤病灶的快速熒光成像。在手術進行過程中，作者將新切除的肺組織與表皮生長因子受體(EGFR)靶向熒光探針孵化，并成功地使用NIR-II熒光成像系統(tǒng)準確地可視化腫瘤的位置和邊界。接下來，作者測試了此方法檢測淋巴轉移的能力。該方法可幫助醫(yī)護人員測量切緣距離，發(fā)現(xiàn)切緣內(nèi)殘留的腫瘤細胞，制定進一步的手術方案。

 

研究內(nèi)容：作者首先量化了EGFR在人外科生物標本中的表達(n= 30)。在所有標本中，分析了腫瘤和正常肺組織，發(fā)現(xiàn)與正常肺組織相比，腫瘤中EGFR表達明顯增加(Figure 1a)。腫瘤組織EGFR陽性區(qū)域平均值為31.4%±3.8%(平均±SD)，顯著高于正常肺組織(20.1%±3.1%，P < 0.001;Wilcoxon檢驗)(Figure 1b)。

Figure 1

 

作者接著完成了EGFR靶向熒光探針的合成及表征。采用抗人EGFR重組抗體scFv片段與近紅外熒光染料IRDye800CW偶聯(lián)制備EGFR-IRDye800CW。IRDye800CW是一種近紅外熒光染料，具有廣泛的吸收峰(778 nm)和發(fā)射峰(794 nm)，具有良好的生物安全性。隨后初步評價了EGFR-IRDye800CW的光譜特性。如Figure 2a所示，EGFR-IRDye800CW的吸收光譜峰為790 nm。與IRDye800CW相比，EGFR-IRDye800CW在260 nm處的吸收峰增強，表明IRDye800CW成功偶聯(lián)到抗人EGFR重組抗體scFv片段上。如Figure 2b和c所示，在接近生理條件下(PBS緩沖液，pH = 7.4)，EGFR-IRDye800CW的熒光信號范圍為800 ~ 1200 nm，峰值發(fā)射在818 nm。EGFR-IRDye800CW的NIR-II熒光成像進一步顯示，當濃度從1 × 10−2增加到1 × 10−1 mg/mL時，熒光信號呈線性增加(R2 = 0.9981，F(xiàn)igure 2d)。透射電鏡(TEM)圖像顯示，EGFR-IRDye800CW的平均粒徑約為10.57 nm(Figure 2e)。通過DLS測量，EGFR-IRDye800CW的水化粒徑增大了27.2 nm。采用生物分子層干涉法(BLI)檢測EGFR-IRDye800CW與抗人EGFR重組抗體scFv片段的結合性。EGFR-IRDye800CW的Kd（結合常數(shù)）為0.545 nM，抗人EGFR重組抗體scFv片段的Kd為0.529 nM。由以上結果可知，抗體與染料偶聯(lián)后，純度略有下降。
 

Figure 2

 

作者繼續(xù)測定EGFR-IRDye800CW的體外細胞靶向能力和細胞攝取。使用western blotting檢測兩種人肺癌細胞系：HCC827細胞(腺癌)和NCI-H520細胞(鱗狀細胞癌)中的EGFR表達。如Figure 3a和b所示，western blot數(shù)據(jù)顯示，HCC827細胞系的EGFR表達量是NCI-H520細胞系的2.1倍，表明EGFR在HCC827細胞系中呈高表達，兩細胞系間存在顯著性差異(P<0.001)。為了測試熒光探針EGFR-IRDye800CW的靶向能力，作者在探針100 nM濃度下培養(yǎng)HCC827 (EGFR陽性)和NCI-H520 (EGFR陰性)細胞3小時。然后，用共聚焦激光掃描顯微鏡對EGFR配體誘導的內(nèi)吞運輸進行熒光成像。如Figure 3c所示，在HCC827細胞中觀察到EGFR-IRDye800CW探針明顯的紅色熒光信號，而在NCI-H520細胞中觀察到紅色熒光信號較弱；還觀察到EGFR-IRDye800CW在HCC827細胞的細胞膜和細胞質(zhì)中有大量的定位。如Figure 3d所示，HCC827細胞的相對熒光強度達到130.3，是NCI-H520細胞(42.1)的3.1倍。同樣，兩種細胞系之間有顯著差異(P < 0.001)。為了進一步研究HCC827細胞對探針的吸收，本文在另外兩組HCC827細胞中進行了實驗——阻斷組和同型對照組。對于阻斷組，采用過量游離西妥昔單抗預處理HCC827細胞以阻斷EGFR。結果表明，抗體對受體的阻斷降低了EGFR-IRDye800CW探針的吸收，在HCC827細胞中只觀察到非常少的熒光(相對熒光強度為66.4，遠低于EGFR-IRDye800CW組)。同型對照組用IRDye800CW標記的人抗IgG重組抗體單鏈抗體片段孵育HCC827細胞;在HCC827細胞中未觀察到該同型對照探針的明顯攝取，相對熒光強度為53.5。這些結果證實了EGFR-IRDye800CW探針在體外有效靶向EGFR。
 

Figure 3

 

作者接著進行了探針在肺癌PDX模型的新鮮組織的體內(nèi)腫瘤選擇性和體外成像研究。體內(nèi)熒光成像顯示EGFR-IRDye800CW探針在腫瘤區(qū)域大量積累。熒光信號在探針注射后8 h達到峰值，腫瘤與正常組織信號比(TNR)達到5.25。作為對照，在注射EGFR-IRDye800CW探針24 h前給阻斷組荷瘤小鼠注射過量的西妥昔單抗。該組的體內(nèi)成像顯示腫瘤區(qū)域熒光信號明顯減弱，TNR變小(阻斷組TNR最大值為1.5)。其同型對照組的TNR為1.1。以上數(shù)據(jù)證實了EGFR-IRDye800CW在HCC827腫瘤中的攝取增強，以及EGFR-IRDye800CW探針在體內(nèi)對腫瘤細胞的靶向能力。器官和腫瘤的體外熒光成像顯示，探針主要集中在肝臟、腫瘤組織和脾臟。免疫組化染色顯示HCC827腫瘤細胞膜和細胞質(zhì)中EGFR呈強陽性。這些結果進一步證實了EGFR-IRDye800CW在高表達EGFR的腫瘤中攝取增強。隨后，作者構建了肺癌的PDX模型，手術切除腫瘤、肺和瘤周組織，利用上述組織，進行了EGFR靶向探針的孵育成像實驗。如Figure 4a所示，腫瘤內(nèi)NIR-II熒光信號增強，而肺和瘤周組織NIR-II熒光信號明顯較弱。免疫組化染色顯示腫瘤中EGFR呈強陽性(Figure 4b)。如Figure 4c所示，EGFR-IRDye800CW組腫瘤的相對熒光強度達到126.6，比肺(82.7)高1.5倍，比瘤周組織高1.8倍。同型對照組腫瘤熒光強度甚至低于肺或瘤周組織組。如Figure 4d所示，EGFR-IRDye800CW組腫瘤:肺和腫瘤:瘤周組織的信噪比(SBR)在1.5 ~ 2.1之間。這些結果證實了EGFR-IRDye800CW能夠特異性地標記腫瘤區(qū)域。

Figure 4

 

作者隨之進行人肺癌樣本的體外成像研究。目的是開發(fā)一種技術，該技術通過在手術過程中提供病例驗證結果(量化邊界距離和疑似轉移淋巴結的鑒別診斷等)來幫助醫(yī)學專業(yè)人員進行病理診斷，且不會干擾組織的完整性或形態(tài)。臨床標本為10例根治肺癌患者手術切除的10個肺組織和60個淋巴結，組織病理學分析顯示，所有腫瘤均為浸潤性腺瘤。染色方案見Scheme 1。切除后，立即將含有可疑腫瘤組織的標本放入含有5%胎牛血清的Krebs-Henseleit 's溶液中，溫度為4-8 ℃，然后轉移到含有1 mg /mL EGFR-IRDye800CW探針的磷酸鹽緩沖鹽水溶液中，孵育20 min。孵育結束后，用含30% PEG-400的磷酸鹽緩沖生理鹽水沖洗3次，每次沖洗1 min。隨即用NIR-II熒光成像系統(tǒng)對標本成像，觀察熒光強度。作者通過H&E染色和免疫組化結果，驗證了該方法應用于人肺癌切除組織鑒別的可行性。此外，該技術還用于驗證肺癌患者術中可疑轉移淋巴結。證明該技術是一種快速的術中病理檢測方法，具有臨床應用價值。

Scheme 1

 

首先是人原發(fā)性腫瘤的體外成像研究。手術切除后，新鮮組織立即按照Scheme 1中步驟孵育并成像。Figure 5顯示了一例典型的不確定肺結節(jié)和包括術前CT掃描在內(nèi)的多模式成像（Figure 5a）Figure 5b顯示了胸腔鏡下腫瘤區(qū)域的白光圖像。手術切除后，切開新鮮組織，暴露腫瘤區(qū)域(Figure 5c-d)，用EGFRIRDye800CW孵育并成像。觀察到組織的部分區(qū)域熒光信號增強，而鄰近組織的熒光信號較弱(Figure 5d)。作者使用標準的H&E染色程序確認這些高亮區(qū)域為腫瘤組織，并通過免疫組化方法確定EGFR在腫瘤區(qū)域高表達。如Figure 5e所示，在熒光圖像上進行線分析取樣，得到其信號強度；線的信號強度顯示出較好的對比，可以勾畫出腫瘤。EGFR-IRDye800CW組腫瘤TNR為2.5±1.3。而用IRDye800CW標記的人抗IgG重組抗體scFv片段孵育的同型對照組，其跨界信號強度幾乎沒有變化。這與之前在動物模型中得到的結果一致，表明EGFR-IRDye800CW可以通過靶向EGFR特異性標記腫瘤細胞。更重要的是，由于腫瘤與正常組織的信號比優(yōu)越，可以清楚地識別腫瘤邊緣。這些結果表明EGFR-IRDye800CW探針可以快速標記和成像肺癌。然后作者評估了此方法是否可以量化邊緣距離。使用ImageJ軟件對體外熒光圖像進行分析，通過先標定1厘米像素的距離，然后測量從熒光信號邊緣到短纖維線的距離，量化邊緣距離，與術后幾天的腔內(nèi)組織病理學分析報告的邊緣進行比較，二者的邊緣幾乎一致。

 

此外，作者還通過組織切片的顯微分析驗證了本文提出的技術的特異性。將肺癌患者腫瘤組織的連續(xù)冷凍切片，用EGFR-IRDye800CW培養(yǎng)后，在NIR-II熒光顯微鏡下觀察。腫瘤細胞區(qū)域有明亮的熒光信號，通過熒光信號可以區(qū)分腫瘤邊緣。更重要的是，EGFR免疫組化證實了熒光信號與EGFR的表達一致。以上結果進一步證實了利用熒光標記的抗人EGFR重組抗體scFv片段進行肺癌靶向成像的可行性。術中使用EGFR-IRDye800CW孵育分離組織時，熒光成像可以清晰地將腫瘤與正常肺組織區(qū)分開來。在腫瘤組織中觀察到熒光信號與EGFR表達的共定位，進一步證明EGFR-IRDye800CW能夠特異性靶向和標記腫瘤細胞。

Figure 5

 

作者接著對人肺癌樣本進行淋巴結轉移的體外成像研究。術前CT掃描顯示可能有淋巴轉移(Figure 6a)，但PET/CT未能檢測到病灶內(nèi)高攝取信號。Figure 6b顯示手術切除淋巴結的體外成像。作者用手術刀片暴露淋巴結內(nèi)部后，立即按照Scheme 1的流程對新鮮淋巴結標本進行孵育成像，并分析成像結果。熒光成像結果如Figure 6c所示。與孤立的良性淋巴結相比，轉移淋巴結的熒光信號增加3倍。采用標準的H&E染色程序來確定高熒光區(qū)域，結果顯示這些高亮區(qū)域包含腫瘤細胞，并通過EGFR免疫組化，確定這些高亮區(qū)域表達了高水平的EGFR。如Figure 6d所示，在熒光圖像上繪制興趣線，得到信號強度；橫線信號強度的明顯對比顯示出淋巴轉移灶。EGFR-IRDye800CW組TNR為2.7±1.1。此外，作者對基于EGFR-IRDye800CW的近紅外熒光成像的平均熒光強度進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)轉移淋巴結的敏感性為77.8%，特異性為92.1%。

Figure 6

 

討論：肺癌是世界上最常見的癌癥之一，每年造成大量的死亡。近年來，在圖像引導的肺癌手術切除中，熒光成像技術得到發(fā)展。但受成像探針和成像系統(tǒng)發(fā)展的限制，該技術在臨床應用中仍面臨諸多困難。

 

本研究證實了利用熒光標記的抗人EGFR重組抗體scFv片段進行肺癌體外快速術中熒光成像的可行性。用EGFR-IRDye800CW孵育離體肺癌組織時，熒光顯像可清晰區(qū)分腫瘤與正常肺實質(zhì)。EGFR-IRDye800CW在表達EGFR的腫瘤組織中的特殊定位使腫瘤可見。組織病理學證實熒光信號和EGFR表達在腫瘤組織中共同定位。這些結果表明，在手術中使用熒光標記的抗人EGFR重組抗體scFv片段培養(yǎng)分離組織，對腫瘤邊界成像和轉移性淋巴結成像是可行的。期望在手術中對腫瘤邊界和切除邊緣距離給出醫(yī)學專業(yè)意見，如術中冰凍切片可以做到的那樣。

 

在本研究中，作者用EGFR靶向的熒光探針培養(yǎng)新鮮切除的肺組織，并使用NIR-II熒光成像系統(tǒng)可視化腫瘤的位置和邊界。將6例患者新鮮切除的肺組織進行體外EGFRIRDye800CW培養(yǎng)，然后用NIR-I/II熒光成像系統(tǒng)成像，分別計算TNR。結果顯示，NIR-II成像的平均TNR為3.13±0.48(范圍2.43 ~ 3.87)，NIR-I成像的平均TNR為2.24±0.29(范圍1.87 ~ 2.63)，NIR-II成像結果的TNR顯著高于NIR-I成像結果(P < 0.01)。導致NIR-II熒光成像中TNR較高的主要因素是正常肺組織中熒光強度的降低。

 

在本研究中，EGFR靶向探針主要用于嚙齒動物標本和人肺癌樣本的體外成像研究，而非體內(nèi)成像；由于探針不是靜脈注射或在體內(nèi)局部給藥，也就不需要探針的安全性或毒性數(shù)據(jù)，這為探針的臨床快速轉譯奠定了基礎。

 

術中病理診斷對術中決策至關重要。通常情況下，術中腫瘤的定位取決于醫(yī)務人員的經(jīng)驗;往往只能得到相對粗糙的腫瘤邊界。即使擴大切除范圍，仍有一些腫瘤可能被遺漏。陽性切緣和微轉移的存在導致8 - 50%的患者腫瘤在術后復發(fā)和轉移。因此，在術中確定腫瘤邊界和發(fā)現(xiàn)微轉移對實現(xiàn)精確的手術切除非常重要。其他技術，如術中超聲技術，腫瘤檢測特異性非常高，但其敏感性不足以導致小病變漏診，且對手術切緣的判斷不足；術中MRI (iMRI)可以顯著提高神經(jīng)外科的準確性和安全性，但由于設備復雜，使用成本高，需要在手術室進行特殊改造等，目前還不能推廣。

 

近年來發(fā)展了一些新的術中成像技術，如用于腫瘤惡性程度判斷的術中拉曼成像和腫瘤邊界成像，有報道指出拉曼成像可用于術中快速病理檢測，展示出一定的應用潛力，但由于拉曼成像本身信號較弱，其靈敏度有待重新評估。

 

綜上所述，本研究中，作者采用靶向近紅外熒光探針在術中培養(yǎng)分離的組織標本，然后使用NIR-II熒光成像系統(tǒng)快速識別切除肺組織中的腫瘤區(qū)域，區(qū)分腫瘤邊界，以及在淋巴結內(nèi)的轉移。值得注意的是，提出的術中快速病理檢測技術可以應用于其他需要局部廣泛切除的領域(如黑色素瘤、結腸癌、外陰癌)，以解決邊緣控制差的問題。

 

局限性：首先，盡管該研究包括了肺癌位點的幾個腫瘤亞位點，并且每個樣本使用了許多數(shù)據(jù)點，但樣本量限制了可以得出的結論。其次，由于碳粉沉積在肺組織表面會干擾熒光成像，該技術在吸煙者或嚴重污染地區(qū)的應用可能受到限制。再者，雖然本文通過免疫組化證實了EGFR在腫瘤細胞和正常肺組織中的表達存在顯著差異，也證實了超過80%的肺癌患者中EGFR過表達。同時利用該技術，證明了EFGR的表達與熒光強度呈正相關，那么在EGFR低表達的患者中，該技術可能導致假陰性結果。最后，已知腫瘤中EGFR分布不均，腫瘤中EGFR表達的顯著不均一性可能會影響腫瘤與正常組織的比值。盡管存在異質(zhì)性和樣本量小的問題，但研究結果表明，本文開發(fā)的方法可以用于腫瘤邊界的識別。

 

總結：熒光標記抗體結合術中熒光成像可成功識別肺癌標本的邊界，和用于體外轉移性淋巴結檢測。這項技術有助于在有限的手術時間內(nèi)做出腫瘤合理切除的決定。

 

參考文獻

doi.org/10.1007/s00259-022-05975-7

 

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