使用H.E.L BioXplorer系統(tǒng)在1至4bar的壓力下對(duì)鉤蟲(chóng)貪銅菌H16進(jìn)行發(fā)酵，使用二氧化碳或糖作為唯一的碳源
Dr. Tuck Seng Wong ^a, Dr. KangLan Tee ^a, Dr. Jasbir Singh ^b, Dr. Mark Appleton ^b
a - University of Sheffield, Sheffield, S1 3JD
^b - H.E.L Ltd, 9-10 Capital Business Park, Borehamwood, WD6 1GW
 

• 摘要

在本研究中，H.E.L BioXplorer被用來(lái)評(píng)估自養(yǎng)模式或異養(yǎng)模式下的微生物發(fā)酵。在自養(yǎng)栽培中，可通過(guò)升高的氣體壓力提升更高的生物質(zhì)生產(chǎn)速率來(lái)直接改善工藝經(jīng)濟(jì)性。氣體溶解度和氣液傳質(zhì)的大幅增加表明，體系同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)溶解氧曲線的精細(xì)控制，這已應(yīng)用于生物燃料和生物酒精生產(chǎn)方面。在容積通常為100mL以上的發(fā)酵罐和高達(dá)60psi（約4bar）的工作壓力范圍內(nèi)，使用CO₂/H₂作為氣體原料的自養(yǎng)栽培的生物量生產(chǎn)率與使用葡萄糖酸鹽作為碳源的異養(yǎng)栽培相當(dāng)。

• 引言

許多生物工藝的商業(yè)可行性可能取決于氣體轉(zhuǎn)移的速度，當(dāng)氣體的溶解度很差，這一點(diǎn)尤其正確。例如，在利用廢氣生產(chǎn)燃料和化學(xué)品的氣體發(fā)酵過(guò)程中，使用氫氣和甲烷等氣體時(shí)，對(duì)于氣體轉(zhuǎn)移不暢的工程解決方案通常僅限于通過(guò)改變噴氣和攪拌來(lái)增加kLa。這提供了非常有限的改進(jìn)空間；因此，許多潛在的有趣的過(guò)程可能會(huì)變得不經(jīng)濟(jì)。一個(gè)更有效的替代方法是在高壓下操作生物反應(yīng)器，因?yàn)檫@可以在不改變噴射或攪拌的情況下將氣體傳輸率提高數(shù)倍。
要進(jìn)一步提高增長(zhǎng)率以證明對(duì)規(guī)�；�使用的投資的合理性，仍需要克服一些挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括，但不限于：氣體密度低，氣體溶解度低（CH₄、H₂、O₂~1 mmol/kg水，CO₂~30 mmol/kg水）和C1氣體轉(zhuǎn)移速度慢，這都會(huì)限制凈轉(zhuǎn)化率。增加發(fā)酵的壓力將有助于加快氣體轉(zhuǎn)移。
 

• 材料和方法

鉤蟲(chóng)貪銅菌是一種廣泛認(rèn)可的將C1來(lái)源轉(zhuǎn)化為一系列不同有機(jī)物的轉(zhuǎn)換器。底物的轉(zhuǎn)化取決于具體的菌株，以及對(duì)菌株的基因改造。本研究中使用的菌株是鉤蟲(chóng)貪銅菌H16，這是一種常見(jiàn)于土壤和淡水中的非致病性細(xì)菌，具有生產(chǎn)多羥基烷酸酯生物塑料的內(nèi)在能力。該菌株以葡萄糖酸鹽和二氧化碳作為碳源生長(zhǎng)。正因?yàn)槿绱耍�發(fā)酵是在異養(yǎng)和自養(yǎng)的條件下進(jìn)行的。
一共測(cè)試了10種發(fā)酵條件，如表1所總結(jié)的。除非另有說(shuō)明，發(fā)酵是在30℃下進(jìn)行的，使用的是在含有1%葡萄糖酸鈉的MSM合成培養(yǎng)基中制備的接種物。培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)，將發(fā)酵液接種到OD₆₀₀ = 0.3。使用0.2 M NaOH和0.2 M H₂SO₄將發(fā)酵液控制在pH 6.8。

#	碳源	壓力(bar)	氣體成分	氣體流速(ml/min)	攪拌速率 (rpm)	備注
1	葡萄糖酸鹽	1	100% Air	100	600	無(wú)pH 監(jiān)測(cè)/控制
2	葡萄糖酸鹽	2		700	600	-
3	葡萄糖酸鹽	4		600	700	無(wú) DO 監(jiān)測(cè)，無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)
4	葡萄糖酸鹽	1		100	600	-
5	葡萄糖酸鹽	3		500	600	壓力增加速率1bar/min
6	CO2	1	85% H2 5% O2 10% CO2	500	600	在OD600≈1的情況下，12小時(shí)后清空O2瓶，重復(fù)運(yùn)行
7	CO2	3		500	600	-
8	CO2	3		500	600	使用自養(yǎng)式預(yù)培養(yǎng)
9	CO2	4		500	600	在早期指數(shù)期的5天后停止生長(zhǎng)
10	CO2	2		500	600	可能由于預(yù)培養(yǎng)物過(guò)舊而沒(méi)有生長(zhǎng)

 
BioXplorer設(shè)置： pH值（探頭：Hamilton，Polilyte Plus XP）、溶解氧（探頭：Hamilton，VisiFerm DO Arc 120）、濁度（探頭：Anglia Instruments，濁度探頭SS316）、溫度（探頭：Helium，PT100 A級(jí)4線）和生物量（探頭：ABER，F(xiàn)UTURApico）。所有參數(shù)都被連續(xù)監(jiān)測(cè)，并通過(guò)H.E.L的WinISO軟件自動(dòng)調(diào)整。除了計(jì)算出的OD₆₀₀值，所有顯示的數(shù)據(jù)都是從WinISO軟件中導(dǎo)出。  

• 結(jié)果和討論

在所有的異養(yǎng)發(fā)酵（運(yùn)行#1-#5）中都觀察到了細(xì)胞的生長(zhǎng)，除了#3是在4bar條件下運(yùn)行的，在最后的培養(yǎng)中沒(méi)有活細(xì)胞。觀察到的最大生長(zhǎng)速度是4號(hào)發(fā)酵的0.326小時(shí)^-1（圖1）。高效液相色譜分析表明，葡萄糖酸鹽在發(fā)酵結(jié)束時(shí)被完全消耗。
  在壓力下的自養(yǎng)性培養(yǎng)是通過(guò)以1bar為單位增加壓力并在每一步增加后保持20分鐘來(lái)實(shí)現(xiàn)的。發(fā)酵過(guò)程#6（圖2）和#7（圖3）顯示如下。
如圖4所示，所有的自養(yǎng)生長(zhǎng)速度都比1bar下的異養(yǎng)生長(zhǎng)速度慢（#4）。將壓力從1bar增加到3bar，生長(zhǎng)速度增加了166%。然而，與1bar相比，增加壓力到4bar時(shí)，生長(zhǎng)速度明顯下降到24%。這表明，鉤蟲(chóng)貪銅菌H16的耐壓性可能是在4bar左右。進(jìn)一步的工作將是必要的，以增加鉤蟲(chóng)貪銅菌在實(shí)驗(yàn)室的耐壓性，這也可以用BioXplorer進(jìn)行。
 

• 結(jié)論

H.E.L BioXplorer成功地被用來(lái)研究壓力對(duì)鉤蟲(chóng)貪銅菌H16在異養(yǎng)和自養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的影響。即使壓力從11bar增加到3bar，異養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)仍然是可行的。這并不奇怪，因?yàn)樵谒�有的壓力下，葡萄糖酸的碳源都很容易獲得。然而，在自養(yǎng)條件下，與1bar相比，壓力達(dá)到3bar時(shí)，生長(zhǎng)率明顯增加到166%。
使用H.E.L BioXplorer清楚地顯示了在壓力下進(jìn)行發(fā)酵的好處。因此，使用高壓進(jìn)行微生物發(fā)酵有可能使自養(yǎng)性生長(zhǎng)在經(jīng)濟(jì)上是可行的。

• 鳴謝

我們要感謝Wong博士、Tee博士和他們的團(tuán)隊(duì)完成了這項(xiàng)工作，并與我們分享這些數(shù)據(jù)。我們與謝菲爾德大學(xué)的研究合作得到了BBSRC C1Net BIV、BBSRC IAA和RAEng的支持。The Leverhulme Trust Senior Research Fellowship（授予黃博士，H.E.L.為工業(yè)伙伴）

• 客戶(hù)

Human Technopole	Italy	BioXplorer 100
Merck	USA	Bioxplorer 400P XL
Aberystwyth University	UK	BioXplorer 100
University of Cologne	Germany	BioXplorer 100
Electrochaea GmbH	Germany	BioXplorer 5000P
University of Chicago	USA	BioXplorer 5000
浙江大學(xué)	China	BioXplorer 5000
CHr Hansen	Denmark	BioXplorer 100
Universidad Politécnica de Madrid (UPM)	Spain	BioXplorer 100
University College Cork, Ireland University College Cork	Ireland	BioXplorer 400