目前，患有急性白血病或骨髓增生異常等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的患者，在經(jīng)過同種異體造血干細(xì)胞移植（HSCT）治療后，仍然面臨復(fù)發(fā)的可能，復(fù)發(fā)是導(dǎo)致治療失敗的主要原因之一。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK），在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中均顯示出有效的抗白血病細(xì)胞毒性，因此，CIK細(xì)胞的應(yīng)用，可作為一種有前景的免疫治療方法，用于對(duì)抗復(fù)發(fā)。

考慮到復(fù)發(fā)患者迫切的治療需求，德國法蘭克福大學(xué)的一支研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出了一種高效的培養(yǎng)工藝，可以利用供體來源的外周血（PB）或白細(xì)胞去除術(shù)（LP）產(chǎn)品生成不同臨床劑量的即用型CIK細(xì)胞，解決了與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的血清供應(yīng)瓶頸的問題，有效地節(jié)省了時(shí)間、人力和成本消耗，且符合良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）。

CIK細(xì)胞的生成

常規(guī)的CIK細(xì)胞培養(yǎng)需要3周的時(shí)間。考慮到患者治療時(shí)間的緊迫性，研究人員專注于在更短的時(shí)間內(nèi)生成高效的CIK細(xì)胞產(chǎn)品。

通過在培養(yǎng)的第4和第8天添加IL-15，可以使原始材料中具有CIK細(xì)胞表型的細(xì)胞在10-12天內(nèi)擴(kuò)增。與對(duì)照組相比，IL-15激活的CIK細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)，并且在幾種已建立的人類白血病異種移植小鼠模型中具有廣泛的體內(nèi)抗白血病功效，使受體存活率提高。采用此種方法，可以建立一個(gè)高效的、符合GMP規(guī)范的CIK細(xì)胞生產(chǎn)工藝，用于提供不同臨床劑量規(guī)格的細(xì)胞產(chǎn)品：1 × 10^6，5 × 10^6，1 × 10^7，1 × 10^8 T細(xì)胞/kG受體體重，滿足不同患者的需要。

開發(fā)替代血清的培養(yǎng)方法
CIK細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)需要添加血清，由于臨床條件下的生產(chǎn)經(jīng)常會(huì)面臨AB血清短缺的瓶頸，研究人員致力于尋找可作為AB血清替代品的培養(yǎng)基補(bǔ)充劑。
通過分別測(cè)試添加AB血清、新鮮冷凍血漿（FFP）、血小板裂解物（PL）的培養(yǎng)效果，發(fā)現(xiàn)與沒有補(bǔ)充劑的對(duì)照組相比，AB血清、FFP和PL的存在均可顯著提高細(xì)胞的擴(kuò)增速率（10倍），但在這3這種補(bǔ)充劑之間未觀察到顯著差異。
進(jìn)一步的檢測(cè)結(jié)果顯示，與AB血清相比，用FFP和PL培養(yǎng)的CIK細(xì)胞顯示出相同的活力、表型（CIK細(xì)胞由CD3+CD56陽性的T細(xì)胞、T-NK細(xì)胞和少數(shù)NK細(xì)胞組成）以及針對(duì)白血病靶細(xì)胞系THP-1的細(xì)胞毒性。

注：考慮到FFP更容易獲得，研究人員已決定采用FFP作為CIK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的補(bǔ)充劑，并在此基礎(chǔ)上對(duì)之前的生產(chǎn)許可文件（ATMP § 4b Abs, 3 AMG，許可證號(hào)：PEI.A.11630.01.1）進(jìn)行了相應(yīng)修改。
CIK細(xì)胞的冷凍保存與活力恢復(fù)
按照預(yù)定的給藥劑量，對(duì)生成的CIK細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，可以最大限度地減少細(xì)胞供應(yīng)的時(shí)間和成本。由于此前的報(bào)道缺乏關(guān)于冷凍保存和解凍后CIK細(xì)胞的活力、細(xì)胞毒性等信息。研究人員補(bǔ)充分析了CIK細(xì)胞在經(jīng)過過夜凍存和長期凍存（2年）后的細(xì)胞毒性潛力，結(jié)果令人鼓舞：

經(jīng)冷凍保存的CIK細(xì)胞仍然具有很高的穩(wěn)定性和活力：凍存前的存活率為95.9%，過夜凍存后的存活率為92.8%，長期（2年）凍存后的存活率為89.3%。
注：使用可控速率的BIOFREEZE BV45程序降溫儀（Consarctic），可將CIK細(xì)胞穩(wěn)定而安全地保存于冷凍袋中，在液氮中儲(chǔ)存過夜。

 

注：通過臺(tái)盼藍(lán)染色，對(duì)2016以來的42個(gè)解凍樣本進(jìn)行分析（此項(xiàng)分析內(nèi)容屬于產(chǎn)品發(fā)布之前QC的一個(gè)重要組成部分），在所有情況下，被測(cè)樣本均滿足>70%存活率的要求�；�于這些結(jié)果，CIK細(xì)胞的冷凍保存方法已獲得當(dāng)局（Paul-Ehrlich-Institute）批準(zhǔn)。

同時(shí)，經(jīng)冷凍保存后的CIK細(xì)胞的恢復(fù)能力、表型、細(xì)胞毒性，均與新鮮制備的CIK細(xì)胞無顯著差異。
技技術(shù)亮點(diǎn)：

CIK細(xì)胞在補(bǔ)充FFP的培養(yǎng)條件下可以保留增殖、活力、表型和功能等主要特征，這些特征在冷凍保存后依然不受影響。研究人員據(jù)此成功建立了符合GMP的CIK細(xì)胞生產(chǎn)工藝，能夠有效減少生產(chǎn)不同治療劑量的CIK細(xì)胞所需的時(shí)間、人力及成本投入。

由于整個(gè)生產(chǎn)工藝對(duì)質(zhì)控有著非常高的要求，最終的細(xì)胞治療效果取決于很多環(huán)節(jié)，其中涉及的與樣本相關(guān)的凍存、溶解以及在液氮中的長期儲(chǔ)存，對(duì)于后續(xù)細(xì)胞治療的效果尤其重要。對(duì)于凍存，研究人員選擇了Consarctic品牌的BIOFREEZE BV45程序降溫儀，使用液氮制冷，低溫存儲(chǔ)溫度可低至-196℃，提供針對(duì)不同細(xì)胞的冷凍程序，尤其適合于活細(xì)胞樣品的保存。

參考文獻(xiàn)：
Improving Clinical Manufacturing ofIL-15 Activated Cytokine-InducedKiller (CIK) Cells, Front Immunol. 2019 May 31;10:1218. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01218. 

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