小鼠基礎(chǔ)知識系列七：小鼠配繁和鑒定策略（本文）
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一般來說，Cre小鼠和Floxed小鼠是兩個不同的品系，通過配繁的方式將它們整合到同一只小鼠身上。那么正確且快速的配繁策略是什么呢？繁育后得到的后代小鼠又如何鑒定以挑選出目標(biāo)基因型呢？在今天的課堂上，J博士將圍繞著這兩個問題展開。
 
 
01 小鼠配繁策略

▲ 條件性敲除小鼠（conditional knockout, cKO）
 
cKO小鼠通常需要把兩個等位基因全部刪除，才能達到基因敲除的目的，所以其floxed等位基因的基因型應(yīng)該為純合。而一般情況下，我們在使用cre時往往選用半合子的形式。這是因為：第一，保證cre基因的拷貝數(shù)一致，避免重組效率不同導(dǎo)致實驗可重復(fù)性差；第二，有時cre基因的構(gòu)建為轉(zhuǎn)基因隨機插入的形式，可能會破壞內(nèi)源基因的表達，使用半合子在一定程度上可以避免轉(zhuǎn)基因插入效應(yīng)帶來的影響。所以，cKO小鼠的目標(biāo)基因型一般為cre/+;flox/flox，通常在F2代才能獲得該基因型小鼠。
 
例如：B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J, 該品系是由mouse Albumin增強子/啟動子驅(qū)動的Cre小鼠，與floxed小鼠配繁，可以靶向肝臟組織進行特異性敲除。產(chǎn)生Cre/lox肝臟組織特異性敲除的最高效的育種方案如下：首先如圖1，為了產(chǎn)生雜合子的floxed等位基因和半合子的Alb-cre轉(zhuǎn)基因小鼠品系，將感興趣的純合子floxed小鼠與Alb-cre轉(zhuǎn)基因小鼠株系交配。大約50%的后代為floxed等位基因雜合子，cre轉(zhuǎn)基因為半合子（cre/+;flox/+）。
 
將這些小鼠與純合子的floxed小鼠配對(見下圖)。這種交配產(chǎn)生的后代中，25%的小鼠為攜帶Alb-cre的floxed等位基因的純合子小鼠。這些就是需要的實驗小鼠。這類小鼠在肝臟中，感興趣的等位基因被全部敲除，但在肝臟以外的組織只是攜帶LoxP位點，并不影響基因的表達。
  通常來說，根據(jù)所需基因型和原始品系的基因型，即可推算出合適的配繁策略。上述方法是理想的較為高效的方法，但在實際實驗中，還需要具體案例具體分析。
 
 
此外，需要注意的是以下幾點：
 
① Cre基因是否和floxed小鼠在同一染色體，是否會發(fā)生連鎖反應(yīng)。在選擇品系的時候，盡可能選擇Cre和floxed基因在不同染色體上的品系；
② 在配繁過程中cre/+;flox/flox小鼠是否可以存活和可育；
③ 我們往往還需要在配繁中得到同窩對照小鼠，因此在設(shè)計配繁策略時也要考慮到這一點。比如下表中，選用不同的對照鼠推薦的親本小鼠基因型（不考慮致死或不育現(xiàn)象）
 

 
 
▲ 條件性過表達小鼠

Cre/lox系統(tǒng)除了可以用來條件性敲除內(nèi)源基因，也可以用來條件性過表達基因。在啟動子和轉(zhuǎn)基因編碼序列之間適當(dāng)插入“loxp-STOP-loxp, LSL”序列(轉(zhuǎn)錄終止元件)，用以阻止基因的表達。Cre重組酶可以去除loxp位點間的終止元件，因此基因只在具有Cre活性的細(xì)胞中表達。與cKO條件性敲除小鼠兩條等位基因都需要純合不同，條件性表達小鼠通常只要有1條等位基因攜帶突變即可滿足實驗要求，因此基因型通常需是Cre/+;flox/+，在F1代即可獲得目的小鼠。
 
例如：使用STOCK Tg(MMTV-cre)4Mam/J（#003553）cre小鼠和B6.129S4-Krastm4Tyj/J（#008179）floxed小鼠進行雜交，如下圖。只需要將他們雜交一代，得到的F1代就可以在乳腺中敲除LSL元件，進而特異表達Kras*G12D點突變基因。如果表達的基因是GFP熒光或者LacZ等顯色基因，常常作為報告小鼠品系用來確認(rèn)Cre的特異性。
   
 
02  Cre-Lox小鼠鑒定

我們以基因敲除為例，介紹Cre-Lox小鼠的相關(guān)鑒定。首先需要鑒定小鼠是否為目標(biāo)基因型。cKO小鼠的目標(biāo)基因型是Cre/+; flox/flox, 此時同時使用原始Cre品系和floxed品系的基因型鑒定方法即可。需要注意的是，如果使用了全身表達Cre，則需重新設(shè)計floxed基因敲除后的引物方可實現(xiàn)鑒定。
 
除此以外，我們往往還要鑒定小鼠基因功能上的敲除是否成功，這可以根據(jù)研究需求在不同水平進行分析：
 
▲ 基因組水平：由于發(fā)生基因敲除后，基因片段發(fā)生改變，可以利用PCR產(chǎn)物大小差別來進行鑒定。提取目標(biāo)組織的DNA，通過特定的引物進行PCR鑒定。比如下圖介紹了基因敲除后的引物設(shè)計策略：
   
▲ 轉(zhuǎn)錄水平：基因片段被敲除后，該基因的轉(zhuǎn)錄也可能收到影響。提取目標(biāo)組織的mRNA并反轉(zhuǎn)錄，設(shè)計相關(guān)基因以及內(nèi)參基因的qPCR引物，利用qPCR實驗鑒定該基因轉(zhuǎn)錄水平上是否改變。應(yīng)注意，敲除基因的引物盡量設(shè)計在被敲除的外顯子或其后的外顯子上。
 
▲ 蛋白水平：基因敲除最主要的目的就是造成基因功能的缺失，即蛋白表達的缺失。提取目標(biāo)組織的蛋白進行Western-blot檢測，以鑒定相關(guān)基因?qū)��?yīng)蛋白的表達情況，或利用免疫熒光/組化對組織切片進行蛋白表達水平檢測。
 
 

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