本文要點(diǎn)：無(wú)創(chuàng)成像技術(shù)可以用于可視化骨生長(zhǎng)、異常和代謝，同時(shí)在骨的圖像引導(dǎo)干預(yù)和外科手術(shù)中發(fā)揮著重要作用。然而，目前還沒(méi)有骨特異性NIR-II成像探針，能夠?qū)崟r(shí)無(wú)創(chuàng)檢測(cè)骨生長(zhǎng)和組織微鈣化。本研究基于結(jié)構(gòu)固有靶向(SIT)策略，設(shè)計(jì)靶向近紅外熒光團(tuán)用于骨組織的無(wú)創(chuàng)成像，其中靶向基團(tuán)或藥效團(tuán)被納入熒光團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)中。我們對(duì)先前開(kāi)發(fā)的近紅外熒光團(tuán)進(jìn)行了改進(jìn)，以生成一種腎臟可清除的骨靶向造影劑。該造影劑具有改進(jìn)的光學(xué)性能和生物分布，此外還能產(chǎn)生光熱效應(yīng)(圖1a)。通過(guò)在介碳中引入硫原子，最終熒光團(tuán)的峰值發(fā)射波長(zhǎng)轉(zhuǎn)移到NIR-II范圍內(nèi)，對(duì)光照射的敏感性提高。

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背景: 由于NIR-II熒光成像可穿透組織深處并減少散射，因此在檢測(cè)骨生長(zhǎng)、代謝、轉(zhuǎn)移及其他骨相關(guān)疾病方面，NIR-II熒光成像優(yōu)于常規(guī)可見(jiàn)和NIR-I熒光成像。而P800SO3-PEG對(duì)骨組織具有高親和力，更深的組織成像能力，其在主要器官中最小的非特異性攝取以及對(duì)激光照射的光熱效應(yīng)，使其成為骨靶向治療診斷成像的最佳選擇。

 

方法: 首先，作者為了研究其穩(wěn)定性與濃度的關(guān)系，將P800SO3-PEG溶于DI水中，在5%牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水中制備不同濃度10~250μM的工作溶液。為了獲得光穩(wěn)定性，使用808nm激光二極管以35mW/cm2連續(xù)照射200μL的工作溶液，每30分鐘成像一次，持續(xù)120分鐘。通過(guò)測(cè)量感興趣區(qū)域(ROI)并將熒光強(qiáng)度與起始熒光信號(hào)進(jìn)行比較來(lái)確定其穩(wěn)定性。之后作者為了測(cè)定其光熱效應(yīng)，在10mM DMSO染料原液中在1XPBS溶液中制備30μM的ICG、P800SO3和P800SO3PEG。以PBS作為對(duì)照。將500μL的工作溶液和空白PBS置于1mL試管中，用808nm激光二極管以1W/cm2的速度照射2分鐘，用熱成像相機(jī)成像。每15秒記錄每個(gè)熒光團(tuán)的熱讀數(shù)。

 

作者隨后做了鈣鹽實(shí)驗(yàn)，將碳酸鈣、草酸鈣、羥基磷灰石、磷酸鈣、焦磷酸鈣鹽(25 mg/mL)分別用5μM工作溶液置于1mL的生理鹽水中孵育。將鈣鹽與熒光團(tuán)在室溫下連續(xù)旋轉(zhuǎn)30分鐘。然后用生理鹽水洗滌混合物3次，然后以3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以除去未反應(yīng)的熒光探針。為了比較其結(jié)合親和力，作者將離心后收集的沉淀分散在200μL的生理鹽水中，熒光成像系統(tǒng)測(cè)定分散樣品的熒光強(qiáng)度。所有近紅外熒光圖像在相同的曝光時(shí)間下采集，并以相同的歸一化顯示。

 

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇了CD-1小鼠(6-8周，雄性)和無(wú)體型NCr nu/nu小鼠(6周)。作者為了研究每個(gè)近紅外熒光團(tuán)的生物分布和清除率，從10mM DMSO原液中提取0.25-1.0mM的含5%牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水配制工作溶液，每個(gè)近紅外熒光團(tuán)100μL(25-100 nmol)經(jīng)眶后竇靜脈注射，術(shù)中近紅外熒光成像后處死動(dòng)物，切除主要臟器，包括心、肺、肝、胰、脾、腎、十二指腸、腸、肌肉等，并成像觀察組織特異性生物分布。每個(gè)器官/肌肉上方感興趣區(qū)域(ROI)的熒光強(qiáng)度使用ImageJ版本1.52 2p進(jìn)行量化。信背比記為SBR。

 

作者為了測(cè)定近紅外熒光團(tuán)的組織分布，在CD-1小鼠注射了50 nmol的P800SO3PEG，在100μL的5%wt/vBSA/生理鹽水后的第1天和第14天摘除骨組織。將解剖的組織裁剪并埋入組織-Tek最佳切割溫度(OCT)化合物中，不進(jìn)行預(yù)固定步驟，組織塊在-80℃冷凍。用低溫制冷機(jī)切割Tµm厚的冷凍切片。玻片先進(jìn)行熒光分析，然后進(jìn)行蘇木精和伊紅(H&E)染色。調(diào)整曝光時(shí)間以獲得每個(gè)熒光圖像相似的最大熒光值。作者還從匹配的視場(chǎng)中獲得了h&e染色玻片的亮場(chǎng)圖像。

 

結(jié)果: 骨靶向近紅外熒光團(tuán)的理化性質(zhì)：如圖1b所示，在P800SO3周?chē)�設(shè)計(jì)P800SO3-PEG，用血清穩(wěn)定但靈活的硫醇PEG連接劑取代根草酸連接劑，導(dǎo)致最大吸收光譜和發(fā)射光譜的光束漂移，從而實(shí)現(xiàn)NIR-II尾跡成像。骨靶向近紅外熒光團(tuán)的理化性質(zhì)見(jiàn)表1，分布系數(shù)對(duì)數(shù)D是血液中最終化合物的親脂性和血清蛋白結(jié)合的重要預(yù)測(cè)因子，P800SO3-Cl是親水性的，但通過(guò)在骨架上添加SH或PEG增加了親水性，這分別將對(duì)數(shù)D降低到-7.04和-8.65。而拓?fù)錁O表面積（TPSA）是組織吸收和滲透的指標(biāo)。而表2總結(jié)了在10%胎牛血清(FBS)中測(cè)定的骨靶向近紅外熒光團(tuán)的光學(xué)性質(zhì)，P800SO3-Cl在817 nm處熒光最強(qiáng)，消光系數(shù)高。在同一七甲基氨酸主鏈的中碳上，氧取代導(dǎo)致熒光發(fā)射的低色移，而硫原子取代產(chǎn)生42-45 nm的淺色移，從而實(shí)現(xiàn)了NIR-II尾成像(圖1e,f)。

圖1
 

表1

 

骨靶向近紅外熒光團(tuán)的血漿蛋白結(jié)合，光穩(wěn)定性和光熱效應(yīng)：首先是骨靶向近紅外熒光團(tuán)的血清穩(wěn)定性，作者使用快速平衡透析(RED)裝置測(cè)量了它們的血漿蛋白結(jié)合(PPB)(圖1g)。在濃度為10µM的5%含牛血清白蛋白(BSA)生理鹽水中制備近紅外熒光團(tuán)，在37°C溫和振蕩孵育8h。利用ICG作為對(duì)照。P800SO3-Cl和P800SO3-PEG顯示約40%的PPB，而P800SO3和P800SO3-SH顯著結(jié)合血漿蛋白(>70%)。作者為了測(cè)量了這些近紅外熒光團(tuán)在不同濃度(10-100μM)下的光穩(wěn)定性，在自制的NIR-II成像系統(tǒng)下，使用功率密度為35mW/cm2的808nm激光照射2h，P800SO3和P800SO3Cl在>50µM時(shí)表現(xiàn)出較好的光穩(wěn)定性。然后，作者在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中固定每個(gè)熒光團(tuán)的濃度為30μM，并在808 nm激光下照射樣品2分鐘，以證明其假設(shè)，這些近紅外熒光團(tuán)顯示光熱效應(yīng)如圖1h所示。總的來(lái)說(shuō)，在激光照射下，所有測(cè)試的近紅外熒光團(tuán)都觀察到升高的溫度變化(10-15°C)。其中，P800SO3-PEG和P800SO3-SH表現(xiàn)出最快的光熱效應(yīng)，這與圖S3a中它們的光敏性結(jié)果一致。與P800SO3相比，P800SO3- peg的升溫要高2-4℃，這可能是由于每個(gè)聚甲基鏈的電子密度和空間位阻的差異所致。

 

骨靶向近紅外熒光團(tuán)物理化學(xué)穩(wěn)定性的測(cè)量：作者分別在DI水中制備1mM和5μM工作液，測(cè)定P800SO3-PEG的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。P800SO3-PEG在-80~25°C的廣泛溫度范圍內(nèi)孵育8小時(shí)后顯示了合理的熱穩(wěn)定性。

 

鈣鹽結(jié)合試驗(yàn)：作者進(jìn)一步測(cè)量了NIR-I和NIR-II窗口（圖2a）中NIR熒光團(tuán)的熒光發(fā)射尾部，然后體外測(cè)試這些熒光基團(tuán)結(jié)合生物相關(guān)鈣鹽的能力，包括羥基磷灰石（HA）、碳酸鈣（CC）、磷酸鈣（CP）、草酸鈣（CO）和焦磷酸鈣（CPP）。在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的五種主要鈣鹽中，HA是主要成分，也存在于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和骨腫瘤中。通常，在測(cè)定中，沒(méi)有熒光基團(tuán)與CPP表現(xiàn)出強(qiáng)烈的結(jié)合。與其他3種熒光基團(tuán)相比，P800SO3-Cl在NIR-I和近紅外-II窗口內(nèi)與HA的結(jié)合力更強(qiáng)，但其在HA、CC、CP和CO之間的結(jié)合差異很小�？傮w而言，NIR-II窗口中骨靶向藥物的信號(hào)強(qiáng)度比NIR-I窗口中的信號(hào)強(qiáng)度高十倍。為了找到更詳細(xì)的與鈣鹽的結(jié)合模式和形態(tài)，選擇P800SO3-PEG并在近紅外顯微鏡下觀察。如圖4所示，在HA、CP和CO中觀察到較強(qiáng)的信號(hào)，但在CPP中幾乎沒(méi)有觀察到任何信號(hào)，表明結(jié)合最小，這與圖2b中的體外數(shù)據(jù)一致。

圖2

 

骨特異性靶向：作者為了評(píng)估骨特異性結(jié)合以及生物分布和清除率，將50 nmol的每種NIR熒光團(tuán)靜脈內(nèi)施用于CD-1小鼠，并在NIR-I和NIR-II窗口下成像，直到注射后4小時(shí)（如圖3所示）。在成像之前，所有內(nèi)臟器官都被切除，仰臥姿勢(shì)被固定。所有注射的NIR熒光團(tuán)都成功地突出了小鼠的胸椎，腰椎和骶椎，以及脊髓肋骨，髂骨和膝關(guān)節(jié)，具有高熒光信號(hào)（圖3a，b）。P800SO3-Cl的LogD值相對(duì)較高，對(duì)HA的結(jié)合選擇性較差，因此在肌肉和皮膚中表現(xiàn)出較高的非特異性攝取，導(dǎo)致三者中的SBR最低（NIR-I≈2.3，NIR-II≈3.9）。另一方面，P800SO3-SH由于在低濃度（<50μM）下光穩(wěn)定性差，因此在骨骼和背景組織中顯示出整體低信號(hào)。P800SO3-PEG呈現(xiàn)出最小的背景信號(hào)，整個(gè)骨骼結(jié)構(gòu)清晰地凸顯出來(lái)。

圖3

 

生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)：作者評(píng)估了P800SO3-PEG的藥代動(dòng)力學(xué)和排泄途徑（圖4a）。P800SO3-PEG迅速分布到全身，并迅速?gòu)难�液中清除。不像P800SO3，P800SO3的間隙較慢。因此，P800SO3-PEG在曲線下顯示小面積（AUC）和合理的清除率（0.23 mL / min），導(dǎo)致4小時(shí)內(nèi)快速排泄尿（74%ID）。

 

無(wú)創(chuàng)NIR-II成像：在NIR-II窗口中，在測(cè)試的劑量范圍內(nèi)清楚地檢測(cè)到顱骨，肩胛骨，脊柱，髂骨和部分股骨。在50nmol的劑量下獲得22.0±1.3的最大平均SBR值。P800SO3-PEG通過(guò)腎臟清除進(jìn)入膀胱而從體內(nèi)消除，即使在最高劑量為100 nmol的情況下，非骨組織也不會(huì)對(duì)其進(jìn)行非特異性攝取。圖4c比較了靜脈注射P800SO3-PEG后小鼠1天和14天的膝蓋，顱骨，脊柱和尾巴的骨成像。放大的骨圖像顯示了組織中骨信號(hào)分布的變化。在膝關(guān)節(jié)中，骨骺和形骺是代謝活躍的區(qū)域，信號(hào)隨著時(shí)間的推移而減少或消失，并重新分布到脛骨和股骨中。另一方面，生長(zhǎng)板中沒(méi)有信號(hào)，因?yàn)樗�是軟骨組織。至于顱骨和上頜骨，隨著時(shí)間的推移，邊緣輪廓信號(hào)變得更加明顯。后軀干的平面形狀顯示脊柱（包括胸椎、腰椎和骶椎）、髂骨和部分背肋骨。在NIR-II窗口下，棘突中的信號(hào)逐漸減少，而橫向過(guò)程中的信號(hào)被保留。圖4c還顯示了非皮膚小鼠的精確尾椎成像。經(jīng)過(guò)兩周的沉積，每個(gè)尾錐都發(fā)出高信號(hào)強(qiáng)度，并且可以在視覺(jué)上分離。椎間盤(pán)中沒(méi)有熒光信號(hào)，因?yàn)樗�是纖維軟骨組織。第1天對(duì)縱向骨骼的H&E和顯微分析顯示骨表面的熒光信號(hào)（圖4d）表明軟骨（白色箭頭），注射后第14天的成像顯示P800SO3-PEG穩(wěn)定地?fù)饺牍腔�質(zhì)（黃色箭頭），隨著時(shí)間的推移，額外的正常骨基質(zhì)沉積在NIR熒光團(tuán)的頂部。對(duì)松質(zhì)骨的顯微鏡分析表明，該區(qū)域的周轉(zhuǎn)率很高（即去除P800SO3-PEG標(biāo)記的組織（藍(lán)色虛線）和/或延遲新骨沉積（無(wú)熒光）。

圖4

 

3D熒光層析成像：計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）是最常見(jiàn)的成像方法，廣泛用于在宏觀和微觀水平上提供骨骼圖像。此外，由于廣角（360°）采集熒光數(shù)據(jù)，3D熒光斷層掃描提供了查看深層組織NIR熒光成像的機(jī)會(huì)。熒光發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（FLECT）/CT系統(tǒng)通過(guò)采集動(dòng)物主體周?chē)��?60°投影圖像并隨后進(jìn)行精確的圖像重建，可以捕獲真實(shí)的3D斷層掃描圖像。圖5顯示了在InSyTe FLECT / CT成像系統(tǒng)下通過(guò)3D熒光斷層掃描P800SO3-PEG在各種骨組織中的體內(nèi)分布。與其他組織相比，P800SO3-PEG在注射后4 d顯示出明顯的骨攝取。圖5a顯示了P800SO3-PEG在脊柱和骨關(guān)節(jié)中的積累。該數(shù)據(jù)還表明P800SO3-PEG優(yōu)先積累在代謝活躍的骨骼區(qū)域。殘余微弱的腎臟信號(hào)表明P800SO3-PEG的腎清除率穩(wěn)定。冠狀動(dòng)脈和矢狀面圖像還顯示P800SO3-PEG在膝蓋，肩部和脊柱中大量積聚（圖5b，c）。

圖5

 

結(jié)論:  P800SO3-PEG與骨基質(zhì)具有高效快速的結(jié)合，并且由于由雙膦酸鹽和磺酸鹽以及柔性硫醇PEG連接劑組成的平衡骨架，腎臟清除率相對(duì)較快。與我們之前報(bào)道的骨靶向藥物P800SO3和其他基于雙膦酸鹽的NIR熒光造影劑相比，P800SO3-PEG具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1）通過(guò)更高的SBR改善骨特異性靶向。2）最大吸收和發(fā)射光譜在800nm左右，與傳統(tǒng)的NIR成像系統(tǒng)兼容。3）改進(jìn)了NIR-II窗口下的無(wú)創(chuàng)成像。4）硫醇誘導(dǎo)的光熱療法治療骨腫瘤，轉(zhuǎn)移和傳染病。此外，與主要保留在體內(nèi)或顯示緩慢肝膽排泄的典型NIR-II熒光納米顆粒不同，腎透明P800SO3-PEG顯示出快速排泄和良好的生物相容性，不會(huì)干擾肝臟，脾臟和其他器官。P800SO3-PEG對(duì)骨組織具有較高的親和力，具有較強(qiáng)的組織成像能力，在主要器官的非特異性吸收最小，且具有激光照射下的光熱效應(yīng)，是骨靶向治療成像的最佳選擇。

 

 

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1186/s40824-022-00294-2

 

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