本文要點(diǎn)：通過(guò)單個(gè)熒光團(tuán)同時(shí)檢測(cè)不同的疾病具有挑戰(zhàn)性。本文報(bào)告了一種名為Cy-914的雙色熒光團(tuán)，利用其NIR-I / NIR-II雙色成像功能同時(shí)診斷非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和轉(zhuǎn)移性腸癌。pKa為6.98的Cy-914對(duì)pH值和粘度都具有高敏感性。在酸性腫瘤微環(huán)境中，795 nm處顯示NIR-I熒光，同時(shí)在中性至微堿性條件下914/1030 nm處顯示強(qiáng)烈的NIR-II熒光。此外，Cy-914可以靈敏且無(wú)創(chuàng)地監(jiān)測(cè)NAFLD進(jìn)展過(guò)程中的粘度變化。更重要的是，它能夠在兩個(gè)獨(dú)立的通道中同時(shí)顯示NAFLD（ex / em = 808 / 1000-1700 nm）和腸道轉(zhuǎn)移（ex / em = 570 / 810-875 nm），且局部噴灑后沒有光譜交叉干擾，進(jìn)一步改善了小于3 mm的微小轉(zhuǎn)移灶的熒光引導(dǎo)手術(shù)。

---

背景：非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）正在成為最常見的以肝細(xì)胞脂肪變性為特征的慢性肝病，在全球成人中患病率為25%。如果NAFLD沒有及時(shí)診斷和治療，它將有發(fā)生肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，由于轉(zhuǎn)移性腫瘤體積小、血管化程度低、分布散，檢測(cè)和切除轉(zhuǎn)移性腫瘤具有挑戰(zhàn)性。迄今為止，常規(guī)超聲、磁共振成像和計(jì)算機(jī)斷層掃描已被臨床用于NAFLD 和腸癌的診斷。然而，這些方法只能提供解剖學(xué)和病理學(xué)圖像，在靈敏度，空間分辨率和安全性方面受到限制。因此，仍然需要在分子水平上開發(fā)高度靈敏和特異性的診斷方法，以便早期準(zhǔn)確地檢測(cè)NAFLD和轉(zhuǎn)移性腸癌，進(jìn)一步防止其惡化并改善其治療。近紅外區(qū)域（NIR-I：700-900 nm，NIR-II：1000-1700 nm）的熒光成像由于其高靈敏度，良好的時(shí)空分辨率和無(wú)創(chuàng)可視化（特別是在NIR-II窗口中）具有巨大的潛力，由于光子散射和自發(fā)熒光減少，可提供更高的空間分辨率和更深的體內(nèi)組織穿透。因此，可以響應(yīng)生物標(biāo)志物和細(xì)胞微環(huán)境的智能可激活NIR熒光探針有望用于NAFLD和轉(zhuǎn)移性腸癌的早期準(zhǔn)確診斷。

 

研究?jī)?nèi)容：作者首次開發(fā)了三種具有雙色成像能力的雙色熒光團(tuán)（BCFluors），用于NAFLD和轉(zhuǎn)移性腸癌的體內(nèi)診斷。每個(gè)BCFluors都由供體-π-受體（D-π-A）結(jié)構(gòu)，雙鍵橋接轉(zhuǎn)子和苯酚基組成，分別實(shí)現(xiàn)強(qiáng)烈的熒光發(fā)射，對(duì)粘度的敏感響應(yīng)和對(duì)pH的快速響應(yīng)。通過(guò)對(duì)π共軛骨架的擴(kuò)展，產(chǎn)生了一個(gè)名為Cy-914的NIR-I /NIR-II BCFluor，具有可調(diào)的激發(fā)和發(fā)射光譜。在酸性腫瘤微環(huán)境中，pKa為6.98的Cy-914在570 nm激發(fā)下795 nm處顯示開啟NIR-I熒光。同時(shí)，在微堿性粘稠環(huán)境中，Cy-914的峰值吸收將紅移至819 nm，進(jìn)一步觸發(fā)914/1030 nm處的強(qiáng)NIR-II熒光，由于酚羥基的去質(zhì)子化和增強(qiáng)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制，在1200 nm處尾部發(fā)射。隨著粘度的增加， Cy-914 在 914 和 1030 nm 處分別顯示出 72 倍和 53 倍的熒光增強(qiáng)。（Figure.1）

Figure1

 

三種BCFluors的設(shè)計(jì)和合成路線Fig.2a所示。作者選擇了具有D-π-A結(jié)構(gòu)的半菁來(lái)構(gòu)建具有較大斯托克斯位移的BCFluors。BCFluors（Cy-700，Cy-805和Cy-914）是通過(guò)簡(jiǎn)單的克腦文蓋爾縮合反應(yīng)合成的。為了使其對(duì)pH敏感，將酚基與骨架鏈接以調(diào)節(jié)不同pH條件下的熒光發(fā)射波長(zhǎng)。為了使其對(duì)粘度敏感，受體1-乙基苯并[c，d]碘鎓和供體苯酚通過(guò)一到三個(gè)旋轉(zhuǎn)雙鍵橋接。在低粘度介質(zhì)中，這樣的D-π-A結(jié)構(gòu)可以自由旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致激發(fā)態(tài)的強(qiáng)非輻射衰變。反之，在高粘度時(shí)，由于分子內(nèi)自由旋轉(zhuǎn)受限，則會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的熒光。Cy-700、Cy-805 和 Cy-914 具有pH/粘度響應(yīng)的雙色成像能力，在酸性 pH 緩沖溶液中分別在 617、700 和 795 nm 處表現(xiàn)出熒光發(fā)射最大值，在微堿性粘稠?xiàng)l件下分別在 700、805 和 914/1030 nm 處表現(xiàn)出峰值發(fā)射（Figure.2bc）。此外，F(xiàn)ig.2e總結(jié)了這些BCFluors的pKa分別在6.30、6.89和6.98的其他光譜特性。為了進(jìn)一步了解隨著雙鍵數(shù)的增加而波長(zhǎng)的紅移，使用DFT計(jì)算了三個(gè)BCFluors的HOMO和LUMO能級(jí)（Figure.2d）。它們?cè)谡麄�(gè)D-π-A骨架上的離域HOMO和LUMO相似，而它們的HOMO-LUMO帶隙差異明顯，分別為2.52、2.22和1.99 eV，表明通過(guò)雙鍵擴(kuò)大π共軛系統(tǒng)可以有效地縮小能隙，并以顯著的紅移導(dǎo)致NIR吸收和發(fā)射。

Figure2

 

作者繼續(xù)驗(yàn)證Cy-914的光譜特性。由于它具有很高的 NIR-I/NIR-II 雙色成像潛力，首先測(cè)量了 Cy-914 在不同 pH 緩沖溶液中的吸收和發(fā)射光譜。如Figure.3a所示，Cy-914在酸性和堿性條件下表現(xiàn)出顯著不同的光譜性質(zhì)，在pH 5.0檸檬酸鹽緩沖液中，在570/795 nm處顯示出峰值吸收/發(fā)射。在pH值為8.8的檸檬酸鹽緩沖液中，由于酚羥基的去質(zhì)子化和增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過(guò)程，分別觀察到720和914/1030 nm處的峰值吸收和發(fā)射。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)其對(duì)腫瘤酸性pH的敏感性，進(jìn)行了pH滴定。隨著pH值的降低，720 nm處的吸收消失，570 nm處的峰值吸收出現(xiàn)，在795 nm處的峰發(fā)射逐漸增加，pKa為6.98，淺綠色溶液變?yōu)樽仙�（Figure.3bc）。同時(shí)，Cy-914通過(guò)在3.0和11.0之間交替改變pH值，即使在五個(gè)循環(huán)后也具有出色的pH可逆性（Figure.3d）。更重要的是，Cy-914表現(xiàn)出良好的化學(xué)穩(wěn)定性，不受金屬離子，氨基酸和活性氧等常見生物物種的干擾。其中，只有質(zhì)子能夠在795nm處觸發(fā)強(qiáng)烈的NIR熒光（Figure.3e）。值得注意的是，Cy-914在不同pH緩沖液中的熒光圖像表明，它能夠進(jìn)行雙色成像，在酸性條件下顯示NIR-I熒光，以及在中性或微堿性pH下顯示NIR-II熒光（Figure.3f）。接下來(lái)，為了進(jìn)一步研究Cy-914對(duì)粘度的敏感性，作者檢查了探針在不同比例的水 - 甘油混合物中的吸收和熒光發(fā)射光譜。在非粘稠水（pH 8.0）中，由于分子內(nèi)自由旋轉(zhuǎn)，在914nm處觀察到非常弱的熒光。相反，在914/1030 nm處呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的NIR-II熒光，并隨著粘度從0.89 cP（100%水）而逐漸增加到163.60 cP（90%甘油），在914和1030 nm處分別表現(xiàn)出72倍和53倍的熒光增強(qiáng)（Figure.3gh）。作者進(jìn)一步測(cè)試了Cy-914在具有不同極性的不同溶劑中的熒光光譜，只有高粘度才能打開其強(qiáng)烈的NIR-II熒光（Figure.3i）。

Figure3

 

由于Cy-914是一種NIR-I/NIR-II成像染料，其發(fā)射波長(zhǎng)超過(guò)共聚焦顯微鏡的范圍，作者接下來(lái)使用Cy-700進(jìn)行雙色細(xì)胞成像，因?yàn)樗鼈兙哂邢嗨频膒H/粘度響應(yīng)（Figure.4a）。為了檢查Cy-700的細(xì)胞器靶向能力，將HeLa細(xì)胞與Cy-700和線粒體綠色熒光探針一起孵育。如Figure.4b所示，紅色通道和綠色通道融合得非常好，皮爾遜系數(shù)高達(dá)0.91。Cy-700具有良好的線粒體靶向能力，進(jìn)一步應(yīng)用于HeLa細(xì)胞的線粒體粘度成像。制霉菌素是一種眾所周知的藥物，可以破壞線粒體功能障礙并誘導(dǎo)粘度變化。當(dāng)細(xì)胞單獨(dú)與Cy-700一起孵育時(shí)，紅色通道中的微弱熒光（λex：637 納米， λem：663-738 nm）被觀察到(Figure.4c）。相比之下，當(dāng)用制霉菌素預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，顯示約2.5倍的紅色熒光增強(qiáng)（Figure.4e）。為了進(jìn)一步研究其體外雙色成像能力，作者應(yīng)用Cy-700監(jiān)測(cè)線粒體自噬的pH變化。首先將HeLa細(xì)胞與Cy-700孵育2小時(shí)，然后用無(wú)血清培養(yǎng)基處理以用于饑餓誘導(dǎo)的線粒體自噬。綠色通道中的熒光信號(hào) （λex：487 納米， λem：570-620nm）顯著增加，饑餓3 h后熒光增強(qiáng)2.3倍（Figure.4df）。接著進(jìn)一步評(píng)估Cy-914在體外檢測(cè)酸性pH和粘度的能力。如Figure.4gh所示，由于pH值降低，負(fù)載Cy-914的細(xì)胞在饑餓誘導(dǎo)處理時(shí)表現(xiàn)出較高的NIR-I熒光，同時(shí)，由于線粒體粘度增加，制霉菌素處理的細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的NIR-II熒光。

Figure4

 

接下來(lái)應(yīng)用Cy-914來(lái)跟蹤NAFLD小鼠模型中的粘度變化。NAFLD小鼠模型是通過(guò)喂食高脂肪飲食（60千卡%脂肪）和注射地塞米松建立的。然后，在第5天，第10天和第15天將小鼠注射Cy-914，第0天小鼠為正常飲食的對(duì)照組。與正常小鼠相比，不同程度的脂肪肝小鼠表現(xiàn)出顯著更高的NIR-II熒光，特別是在第10天，高信背景比為2.6 / 1。此外，由于腹部脂肪的增加和光穿透的衰減，第15天的NAFLD小鼠顯示出熒光略有下降（Figure.5ab）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證NAFLD的成功產(chǎn)生，在選定的日期分離小鼠的肝臟。正常的肝臟呈現(xiàn)深紅色，表面光滑;相比之下，NAFLD組中擴(kuò)大的肝臟顯示出黃色，表面油膩，肝臟中顯示出更強(qiáng)的NIR-II熒光，高達(dá)1.9倍（Figure.5cd）。此外，蘇木精和曙紅（H&E）染色進(jìn)一步驗(yàn)證了NAFLD模型的成功建立，顯示肝細(xì)胞腫脹和肝索紊亂（Figure.5e）。為了進(jìn)一步檢查生物分布，在注射后1小時(shí)通過(guò)NIR-II熒光成像收獲并分析主要器官（Figure.5f）。Cy-914在肝臟和脾臟中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的NIR-II熒光，并且由于粘度隨著脂肪肝的進(jìn)展而增加，只有肝臟顯示出增強(qiáng)的NIR-II熒光（Figure.5g）。
 

Figure5

 

最后，建立了攜帶NAFLD和轉(zhuǎn)移性腸癌的小鼠模型。如Figure.6a所示，首先用高脂肪飲食喂養(yǎng)小鼠并注射地塞米松以誘導(dǎo)脂肪肝，并在第5天，腹膜內(nèi)注射用熒光素酶表達(dá)的4T1-Luc細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性腸腫瘤。在腹部觀察到顯著的生物發(fā)光信號(hào)，表明成功產(chǎn)生腸道轉(zhuǎn)移（Figure.6b）。在肝臟和腸道表面局部噴灑Cy-91430秒后，強(qiáng)烈的NIR-II熒光（λex：808 nm， λem：1000-1700nm）在脂肪肝中快速清晰地觀察到，顯示出比正常肝臟高1.6倍的熒光，同時(shí)在腹部有顯著的NIR-I熒光信號(hào)（λex：570nm，ICG通道）伴有腸道轉(zhuǎn)移，顯示1.9倍高的熒光（Figure.6bc）。為了進(jìn)一步檢查離體熒光，收獲了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的肝臟和腸道，在脂肪肝中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的NIR-II熒光，在轉(zhuǎn)移性腸腫瘤中表現(xiàn)出NIR-I熒光（Figure.6d）。值得注意的是，通過(guò)利用局部噴灑和NIR熒光引導(dǎo)手術(shù)，可以清楚地檢測(cè)到小于3 mm的微小腸道轉(zhuǎn)移并精確切除，通過(guò)生物發(fā)光成像和H&E染色分析進(jìn)一步證實(shí)（Figure.6e）。

Figure6

 

總結(jié)：作者成功設(shè)計(jì)并合成了BCFluor，Cy-914，具有pH和粘度響應(yīng)特征，用于體內(nèi)雙色疾病診斷，沒有光譜交叉干擾。探針Cy-914通過(guò)響應(yīng)pH/粘度表現(xiàn)出可調(diào)諧的NIR-I/NIR-II熒光，在酸性微環(huán)境中顯示出顯著的NIR-I熒光（795 nm），在中性至微堿性條件下表現(xiàn)出強(qiáng)烈的NIR-II熒光（914/1030 nm）。值得注意的是，它能夠通過(guò)利用NIR-II熒光成像來(lái)靈敏且無(wú)創(chuàng)地監(jiān)測(cè)NAFLD進(jìn)展中的粘度變化。更重要的是，Cy-914允許在局部噴灑后在兩個(gè)獨(dú)立的通道中同時(shí)檢測(cè)NAFLD和轉(zhuǎn)移性腸癌，進(jìn)一步改善了熒光引導(dǎo)下小于3mm的微小腸轉(zhuǎn)移的手術(shù)切除。該研究為通過(guò)單個(gè)熒光團(tuán)進(jìn)行多疾病診斷提供了一種新穎的策略，Cy-914有望在未來(lái)用于檢測(cè)其他pH/粘度相關(guān)疾病的應(yīng)用。

 

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03100

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

 恒光智影

上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，專注于近紅外二區(qū)成像技術(shù)。致力于為生物醫(yī)學(xué)、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供先進(jìn)的、一體化的成像解決方案。自主研發(fā)近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)-MARS。

與基于可見光波長(zhǎng)的傳統(tǒng)成像技術(shù)相比，我們的技術(shù)側(cè)重于X射線、紫外、紅外、短波紅外、太赫茲范圍，可為腫瘤學(xué)、神經(jīng)學(xué)、心血管、藥代動(dòng)力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果，助力科技研發(fā)。

同時(shí)，恒光智影還具備探針研發(fā)能力，我們已經(jīng)成功研發(fā)了超過(guò)15種探針，這些探針將廣泛地應(yīng)用于眾多生物科技前沿領(lǐng)域的相關(guān)研究中。