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生物反應(yīng)器應(yīng)用：人間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC培養(yǎng)及放大過(guò)程工藝關(guān)鍵
人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）在治療神經(jīng)、骨骼、關(guān)節(jié)和心血管等疾病上顯示出了良好的發(fā)展前景。異源hMSC由于其低免疫排斥性和低制造成本顯示出了更大的發(fā)展?jié)摿ΑＥR床試驗(yàn)中，治療效果很大程度上取決于給患者輸入的合格細(xì)胞數(shù)量。因此，體外擴(kuò)增獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞、降低生產(chǎn)成本，以及擴(kuò)增系統(tǒng)的持續(xù)穩(wěn)定性將是未來(lái)細(xì)胞治療商業(yè)化的關(guān)鍵。
工業(yè)研究表明，與傳統(tǒng)平面擴(kuò)增方法相比，使用微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)可以獲得近80倍的單位體積細(xì)胞產(chǎn)量，同時(shí)所占空間更少?gòu)亩档土苏w制造成本。在生物反應(yīng)器中微載體懸浮培養(yǎng)具有易于擴(kuò)展、更均勻的營(yíng)養(yǎng)分布、可以實(shí)現(xiàn)在線/離線監(jiān)測(cè)、可以實(shí)施多種補(bǔ)料策略等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)還可以更好地滿(mǎn)足FDA對(duì)實(shí)施過(guò)程分析技術(shù)（PAT）的建議。
與平面擴(kuò)增方法不同，微載體培養(yǎng)需要攪拌使培養(yǎng)基均質(zhì)化，氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞代謝物交換也需依賴(lài)傳質(zhì)完成。攪拌還會(huì)帶來(lái)剪切力，也將影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí)，由于細(xì)胞附著微載體主要靠細(xì)胞和微載體之間的碰撞和粘附，這一過(guò)程也將比平面培養(yǎng)耗時(shí)更久。Bioprocessing of Human Mesenchymal Stem Cells: From Planar Culture to Microcarrier-Based Bioreactors中討論了微載體hMSC擴(kuò)增中生物反應(yīng)器的重要過(guò)程參數(shù)，如溫度、pH、DO、攪拌和進(jìn)料策略，以滿(mǎn)足更復(fù)雜的生物過(guò)程需求。
攪拌
生物反應(yīng)器攪拌速率保持在所需的速度下限，可以在滿(mǎn)足傳質(zhì)需求的條件下避免微載體在死區(qū)的聚集。保持微載體懸浮的攪拌速度下限可以通過(guò)可視化或粒子圖像測(cè)速進(jìn)行確定。找到完全懸浮所有微載體的閾值攪拌，同時(shí)要確保微載體均勻分散。
此外在利用微載體進(jìn)行生物反應(yīng)器大規(guī)模擴(kuò)增時(shí)還需考慮體積能量耗散的影響，即微載體懸浮所需的單位體積功率輸入與攪拌速度成正比。攪拌速度常需要隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，以抵消較重微載體造成的聚集。與混合相關(guān)的另一個(gè)因素是葉輪尖端速度。由于葉輪尖端剪切應(yīng)力高，對(duì)細(xì)胞造成的潛在損害也是較大的。因此，選擇合適的葉輪的尺寸和幾何形狀對(duì)可行性至關(guān)重要。
適于細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器槳葉控制系統(tǒng)（溫度、pH和DO）
hMSC培養(yǎng)適宜溫度通常為37°C。生物反應(yīng)器通常配備有溫度控制單元，該溫度控制單元接收來(lái)自溫度傳感器的信號(hào)。在生物反應(yīng)器培養(yǎng)中有兩種調(diào)節(jié)溫度的方法。一種是保持生物反應(yīng)器水套的溫度；另一種是通過(guò)熱電偶或溫度傳感器測(cè)量溫度來(lái)直接控制并使用加熱毯或墊加熱生物反應(yīng)器。前者可能由于間接測(cè)量而有一些偏差，而后者需要關(guān)注溫度傳感器和熱源的相對(duì)位置。
高細(xì)胞密度的微載體培養(yǎng)需要對(duì)pH值進(jìn)行更精細(xì)的控制，這對(duì)軟件PID控制功能提出了要求。pH設(shè)定值通常介于7至7.5之間，可通過(guò)稀釋堿（例如，NaOH、NaHCO3）和稀釋酸（例如，H2SO4）或CO2氣體來(lái)控制pH值。盡管生物反應(yīng)器每次使用前必須校準(zhǔn)在線pH電極，但結(jié)合離線校準(zhǔn)可提高細(xì)胞增殖期間的測(cè)量精度。
D2MS多參數(shù)設(shè)置與視頻流監(jiān)控軟件界面
溶解氧（DO）是維持代謝活動(dòng)和細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素。生物反應(yīng)器供氧有兩種方式：底通（sparger)和表通(overlay)。與微生物發(fā)酵相比，hMSC培養(yǎng)過(guò)程中的溶解氧通常可以通過(guò)表通(overlay)曝氣來(lái)保持。但當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到某一臨界值，并氣液表面與體積比太低，則可以考慮底通（sparger)曝氣供氧。
D2MS過(guò)程數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)軟件界面
氧傳質(zhì)速率，表示生物反應(yīng)器中氧傳質(zhì)的效率，由界面面積、傳質(zhì)系數(shù)和氧濃度梯度決定。界面面積由幾何參數(shù)決定，包括生物反應(yīng)器的形狀、尺寸以及噴射氣泡的大小決定。氣泡尺寸越小，界面面積越大，氧傳遞越好。氧傳質(zhì)系數(shù)受混合、能量耗散等因素的影響。有研究表明，在氣流速率為0.05vvm的2-L生物反應(yīng)器中，將攪拌速度從6 rpm增加到20rpm時(shí)，氧傳質(zhì)系數(shù)（kLa）增加了1.7倍。
補(bǔ)料策略
培養(yǎng)基是hMSC生產(chǎn)的主要成本之一。采用合理的補(bǔ)料策略，有利于用更少體積的培養(yǎng)基收獲更大的細(xì)胞產(chǎn)量。分批培養(yǎng)是一種方便且經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)策略。其優(yōu)點(diǎn)有易于操作、低污染風(fēng)險(xiǎn)和更少的培養(yǎng)基用量。但由于營(yíng)養(yǎng)的限制，分批培養(yǎng)無(wú)法實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度培養(yǎng)。
更常見(jiàn)的培養(yǎng)策略是分批補(bǔ)料式培養(yǎng)，可以避免營(yíng)養(yǎng)消耗帶來(lái)的生長(zhǎng)抑制，中途無(wú)需停止攪拌，還保留了hMSC分泌的細(xì)胞因子，并且在擴(kuò)增過(guò)程中沒(méi)有細(xì)胞丟失。但這種培養(yǎng)策略由于環(huán)境改變，可能會(huì)導(dǎo)致單位體積細(xì)胞產(chǎn)量減少。
灌流培養(yǎng)策略可以穩(wěn)定地將新鮮培養(yǎng)基添加到生物反應(yīng)器中，同時(shí)將用過(guò)的培養(yǎng)基泵出。這種策略可以獲得單位培養(yǎng)基體積下更大的細(xì)胞密度。有研究在基于微載體的攪拌罐生物反應(yīng)器中使用相同培養(yǎng)基，用分批補(bǔ)料和灌流培養(yǎng)策略進(jìn)行培養(yǎng)。灌流培養(yǎng)得到的細(xì)胞密度是分批補(bǔ)料的1.28倍。灌注培養(yǎng)補(bǔ)料速率可根據(jù)生長(zhǎng)和離線培養(yǎng)基分析進(jìn)行控制，可以以更少的培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料。
參考文獻(xiàn)：Tsai AC, Pacak CA. Bioprocessing of Human Mesenchymal Stem Cells: From Planar Culture to Microcarrier-Based Bioreactors. Bioengineering (Basel). 2021 Jul 7;8(7):96. doi: 10.3390/bioengineering8070096. PMID: 34356203; PMCID: PMC8301102.
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