乳酸激活的GPR81可通過(guò)激活KLF2來(lái)抑制振蕩剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥
長(zhǎng)期以來(lái)，內(nèi)皮功能障礙和炎癥一直被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的最早事件，因此是一個(gè)有價(jià)值的治療靶點(diǎn)。振蕩剪切應(yīng)力（OSS）通過(guò)觸發(fā)信號(hào)分子的釋放來(lái)激活內(nèi)皮細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)，以響應(yīng)流量感應(yīng)受體的機(jī)械激活。暴露于高剪切應(yīng)力和層流區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)釋放無(wú)數(shù)動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)基因（包括Kruppel樣因子2（KLF2））而具有動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)能力。IL-8 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達(dá)驅(qū)動(dòng)單核細(xì)胞募集到血管系統(tǒng)中的 OSS 區(qū)域，其中粘附分子包括血管粘附分子（VCAM）-1 和內(nèi)皮細(xì)胞選擇素（E-selectin）導(dǎo)致單核細(xì)胞和白細(xì)胞滾動(dòng)并粘附在內(nèi)皮上。
 

KLF2是一種重要的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生具有保護(hù)作用。在層流剪切應(yīng)力誘導(dǎo)下，KLF2下調(diào)VCAM-1和E-選擇素的表達(dá)，從而減弱單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。然而，KLF2在暴露于OSS的動(dòng)脈分支和其他區(qū)域表達(dá)降低，這些區(qū)域長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為容易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員，也密切參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

 

最近，G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）家族作為多種疾病的有價(jià)值的治療靶點(diǎn)受到重視。在GPCR家族的大約800個(gè)成員中，GPR81，也稱(chēng)為羥基羧酸受體1（HCAR1），是一種選擇性乳酸敏感受體，已知在多種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)，包括腦細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、各種癌細(xì)胞和視網(wǎng)膜等。GPR81已被證明在骨髓內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，據(jù)報(bào)道，GPR81介導(dǎo)的乳酸信號(hào)通路可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。

 

在華中阜外醫(yī)院（河南省人民醫(yī)院心臟中心）團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，探索了GPR81介導(dǎo)的乳酸信號(hào)通路在OSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥中的潛在作用。

 

 

首先，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR和蛋白質(zhì)印跡分析，以確定暴露于OSS對(duì)HUVECs中GPR81表達(dá)的影響。如圖1 所示，持續(xù)暴露至 5 dyn/cm2 OSS以時(shí)間依賴(lài)性方式顯著降低HUVECs中GPR81的表達(dá)。在 24 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)下，GPR81 的表達(dá)在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上均降低了 50% 以上。

 

 

圖1   暴露于振蕩剪切應(yīng)力（OSS）抑制了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中的GPR81。HUVECs用OSS處理（5 dyn/cm2） 8、16 和 24 小時(shí)。 

（a）實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示OSS在mRNA水平上降低了GPR81的表達(dá)。
（b）蛋白質(zhì)印跡顯示OSS在蛋白質(zhì)水平上降低了GPR81的表達(dá)。

 

眾所周知，不同的流動(dòng)模式在內(nèi)皮細(xì)胞中引發(fā)不同的生物反應(yīng)。經(jīng)歷OSS的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入促炎狀態(tài)，而暴露于生理高剪切力（HSS）的內(nèi)皮細(xì)胞則具有抗炎特性并表達(dá)動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)分子。通過(guò)將HUVECs暴露于OSS或HSS（15 dyn/cm2）中24小時(shí)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了OSS和HSS對(duì)GPR81表達(dá)的調(diào)控是否不同。結(jié)果表明，HSS在mRNA和蛋白質(zhì)水平上顯著增加了GPR81的表達(dá)，這與OSS的效果相反。這些數(shù)據(jù)表明，剪切應(yīng)力具有直接增加或降低GPR81基礎(chǔ)表達(dá)水平的能力。

 

氧化應(yīng)激是內(nèi)皮功能障礙過(guò)程中的關(guān)鍵因素。因此，研究了乳酸（GPR81特異性激動(dòng)劑）對(duì)OSS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響。如圖2所示，暴露于OSS使線粒體活性氧（ROS）的產(chǎn)生增加到大約四倍。然而，用乳酸處理將ROS的產(chǎn)生降低到僅約1.5倍基線水平，因此表明乳酸具有有效的抗氧化特性。

 

圖2   用乳酸抑制振蕩剪切應(yīng)力（OSS）誘導(dǎo)的線粒體ROS生成。HUVECs在存在或不存在7.5、15 mM乳酸24小時(shí)的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2）。線粒體ROS通過(guò)用MitoSOX紅染色來(lái)測(cè)量。

 

接下來(lái)，確定了乳酸介導(dǎo)的激活參與OSS誘導(dǎo)的幾種關(guān)鍵炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。結(jié)果表明，OSS在mRNA和蛋白質(zhì)水平上觸發(fā)了IL-6、IL-8和MCP-1表達(dá)的顯著增加。然而，乳酸的存在導(dǎo)致這些分子的表達(dá)顯著降低。同時(shí)，乳酸以劑量依賴(lài)性方式將OSS誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)從約5.2倍降低到僅1.8倍。

 

為了確定乳酸對(duì)OSS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響，實(shí)驗(yàn)研究了乳酸對(duì)VCAM-1和E-選擇素表達(dá)的影響。如圖3所示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果表明，OSS分別在mRNA水平，特別是在蛋白質(zhì)水平上顯著增加了VCAM-1和E-selectin的表達(dá)。同時(shí)，兩劑乳酸的加入極大地抑制了OSS誘導(dǎo)的這兩種粘附分子的表達(dá)。為了確認(rèn)乳酸的這種潛在的抗單核細(xì)胞粘附能力，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以確定暴露于OSS時(shí)附著在HUVECs上的人白血病細(xì)胞單核細(xì)胞U937的數(shù)量。結(jié)果表明，OSS將附著的U937細(xì)胞的數(shù)量增加到大約3.3倍，通過(guò)兩劑乳酸以劑量依賴(lài)性方式減少到僅2.1倍和1.5倍。

 

圖3   用乳酸抑制振蕩剪切應(yīng)力（OSS）誘導(dǎo)的VCAM-1和E-選擇素表達(dá)。

HUVECs在存在或不存在7.5、15mM乳酸24小時(shí)的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2）。（a）通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析確定的VCAM-1和E-選擇素的mRNA水平。（b） 通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析確定的 VCAM-1 和 E-選擇素的蛋白質(zhì)水平。

 

最后，實(shí)驗(yàn)研究了KLF2和ERK5通路在介導(dǎo)GPR81激活的這些保護(hù)作用中的參與。結(jié)果表明，暴露于OSS使動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子KLF2的表達(dá)降低了約65%，通過(guò)使用乳酸激活GPR81，KLF2在mRNA和蛋白質(zhì)水平上以劑量依賴(lài)性的方式恢復(fù)到接近基線水平。

 

為了確定ERK5通路在GPR81介導(dǎo)的KLF2表達(dá)恢復(fù)中的參與，首先測(cè)量了暴露于OSS和兩劑乳酸時(shí)的磷酸化和總ERK5水平。如圖4 a所示，OSS顯著降低了p-ERK5的水平，而乳酸以劑量依賴(lài)性方式挽救了p-ERK5的水平。接下來(lái)，使用特異性ERK5抑制劑XMD8-92來(lái)確認(rèn)GPR81對(duì)KLF2的拯救是通過(guò)ERK5介導(dǎo)的。如圖4 b、c所示，抑制ERK5在mRNA和蛋白質(zhì)水平上消除了乳酸介導(dǎo)的對(duì)KLF2表達(dá)的恢復(fù)，從而表明乳酸介導(dǎo)的GPR81激活對(duì)OSS誘導(dǎo)的KLF2表達(dá)抑制的保護(hù)作用取決于ERK5通路。

 

圖4   乳酸誘導(dǎo)的KLF2表達(dá)由ERK5介導(dǎo)。
 

（a）HUVECs在存在或不存在7.5、15mM乳酸24小時(shí)的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2），測(cè)量p-ERK5和總ERK5。（b）HUVECs在存在或不存在15 mM乳酸24小時(shí)或特異性ERK5抑制劑XMD8-92（10 nM）的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2），測(cè)量KLF2的mRNA水平。（c） HUVECs在存在或不存在15 mM乳酸24小時(shí)或特異性ERK5抑制劑XMD8-92（10 nM）的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2），測(cè)量KLF2的蛋白質(zhì)水平。

 

為了進(jìn)一步證實(shí)GPR81參與介導(dǎo)乳酸對(duì)HUVECs中OSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙的保護(hù)作用，用siGPR81轉(zhuǎn)染細(xì)胞。GPR81的成功敲低如圖5 a。重要的是，發(fā)現(xiàn)敲低GPR81消除了乳酸對(duì)OSS誘導(dǎo)的VCAM-1和E-選擇素表達(dá)的抑制作用（圖5 b）。GPR81的沉默也阻止了乳酸對(duì)OSS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞附著于HUVECs的抑制作用（圖5 c）。這些發(fā)現(xiàn)表明，乳酸對(duì)OSS誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)皮功能障礙的抑制作用是由GPR81介導(dǎo)的。

 

圖5   敲低GPR81消除了乳酸對(duì)內(nèi)皮功能障礙的抑制作用。

（a）蛋白質(zhì)印跡分析顯示GPR81成功敲低。（b）通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析測(cè)量VCAM-1和E-選擇素的表達(dá)。（c）測(cè)定U937細(xì)胞與HUVEC的附著。

 

總之，該研究結(jié)果證明了GPR81作為有效的動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)受體的新作用。GPR81在暴露于OSS的血管動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域中的特異性激活可以通過(guò)抑制內(nèi)皮炎癥和氧化應(yīng)激，抑制粘附分子的表達(dá)以及上調(diào)保護(hù)性KLF2轉(zhuǎn)錄因子的低表達(dá)來(lái)抑制動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展。
 

參考文獻(xiàn)：Sun Z, Han Y, Song S, Chen T, Han Y, Liu Y. Activation of GPR81 by lactate inhibits oscillatory shear stress-induced endothelial inflammation by activating the expression of KLF2. IUBMB Life. 2019 Dec;71(12):2010-2019. doi: 10.1002/iub.2151. Epub 2019 Aug 24. PMID: 31444899.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31444899/