一、手術(shù)環(huán)境：

手術(shù)室溫度控制在20-25℃，氣溫較低時可使用加熱裝置來保證實驗動物在手術(shù)中的體溫維持在正常范圍，電熱絲加熱墊會產(chǎn)生較大干擾噪音，在采集信號時應(yīng)將其關(guān)掉。整個操作環(huán)境盡量保持無菌狀態(tài)（可在無菌操作臺中進行）。

 

 二、主要實驗器材：

止血鉗、鑷子、手術(shù)剪刀（大剪刀及小剪刀）、縫合針線、手術(shù)刀柄和刀片、顱骨鉆及鉆頭（0.8mm）、螺絲刀、電動剃、注射器等，所有的手術(shù)器械在使用前均需經(jīng)過嚴格消毒處理。

 

圖1 手術(shù)用器械及其它材料

 三、主要材料及藥品試劑：

無菌生理鹽水、75%醫(yī)用酒精、碘伏、酒精棉及棉簽、脫毛膏、不銹鋼微型螺絲釘（M1*2、M1*3，使用前應(yīng)使用75%酒精充分浸泡清洗），牙科水泥粉、戊巴比妥鈉溶液（1%，現(xiàn)配）、紅霉素眼膏、利多卡因膏、三聯(lián)抗生素、阿托品（1mg/mL）、地塞米松、卡洛芬等。

 

  四、手術(shù)操作步驟

以實驗用大鼠為例。

 

 4.1    稱重

將大小約20*20*20cm的盒子置于電子秤上，去皮，把大鼠放置在盒子內(nèi)（抓大鼠時需戴上防咬手套），讀數(shù)。

 

 4.2    麻醉

中國互聯(lián)網(wǎng)企業(yè)100強榜單主要參考互聯(lián)網(wǎng)企業(yè)年度發(fā)展數(shù)據(jù)，評價指標既覆蓋收入、利潤、人力資本等財務(wù)指標，也覆蓋流量、活躍用戶數(shù)等業(yè)務(wù)指標。
 

麻醉對整個手術(shù)至關(guān)重要，其麻醉的穩(wěn)定性直接影響到手術(shù)結(jié)果的好壞。若要獲得更好的麻醉效果，建議使用異氟烷呼吸麻醉，但由于呼吸麻醉成本較高且麻煩，多數(shù)實驗室還是使用注射麻醉，因此這里以注射麻醉為例。
 

麻醉劑采用1%戊巴比妥鈉溶液（戊巴比妥鈉比水合氯醛麻醉更穩(wěn)定，但容易產(chǎn)痰，咯痰時及時使用吸管吸出），劑量為0.5ml/100g（50mg/Kg）。腹腔注射前先對大鼠用異氟烷短暫麻醉，具體操作：將大鼠放進透明盒子中，此時將蘸有異氟烷的棉球丟入盒子內(nèi)，密封，待大鼠安靜不動，呼吸均勻（1次/秒）時取出。腹腔注射：將大鼠仰面朝向，提起一側(cè)后肢，在大腿根與腹中線的中間位置刺入皮下，在皮下平行于腹中線推進針頭3-5mm，再以45°角向腹腔內(nèi)刺入，針尖通過腹肌后，無阻力，回抽無回流物，緩慢注入麻藥。
 

注射麻藥后，對大鼠進行疼痛反射（掐尾端或后腳掌）和眼角膜反射來判斷麻醉效果。在15min之后還未能完全麻醉的大鼠可適當補加0.2-0.5ml的1%戊巴比妥鈉溶液。若手術(shù)時間較長，應(yīng)每隔1h檢查大鼠麻醉狀態(tài)，當出現(xiàn)疼痛反應(yīng)時，應(yīng)補加0.5ml的1%戊巴比妥鈉溶液。手術(shù)中，應(yīng)將大鼠舌頭從口的一側(cè)拉出，為防止大鼠在麻醉過程中呼吸道出現(xiàn)過多分泌物導(dǎo)致窒息，可在麻醉過程中注射0.5ml阿托品（1mg/ml）。

 

 4.3    備皮

用左手將麻醉后的大鼠托住，右手手持電動剃逆著大鼠毛發(fā)的方向（從后往前）將頭頂?shù)拿�發(fā)剃除，一般剃毛范圍是兩耳之間，前至兩眼間，后至頸部始端。若要達到更好的干凈度，可涂抹少量脫毛膏，使用后需要使用生理鹽水清洗掉殘余物。

 

 4.4    固定

大鼠固定的好壞會直接影響到手術(shù)中信號采集的穩(wěn)定性，甚至會影響到慢性植入后的效果。
 

首先將一側(cè)耳桿固定，找到大鼠耳道稍向前上方的骨性凹陷處（可以用手觸摸到），將其中一側(cè)的凹陷處貼在固定的耳桿上（提前涂抹少量利多卡因藥膏可以避免耳桿對大鼠刺激），此時將另一側(cè)耳桿也插入對應(yīng)的位置，調(diào)節(jié)兩側(cè)耳桿長度，使之對稱，固定緊耳桿。左右及上下輕輕移動大鼠的頭部，避免出現(xiàn)松動及偏斜。
 

在固定好大鼠耳桿后，還需將大鼠的上門齒固定。具體操作：將大鼠上門齒卡進門齒桿的槽內(nèi)，下頜處于門齒桿的下方，然后下調(diào)兩側(cè)的眼眶固定桿，壓緊并固定。適當調(diào)整各固定點，使得大鼠的整個顱骨面保持水平，從各個方向用力均不能移動大鼠的頭部。
 

最后在大鼠的眼部涂抹上紅霉素眼膏或甘油，以防止手術(shù)燈的長時間照射造成眼部損傷以及保持眼睛的濕潤。另外，要用圓頭鑷子將大鼠的舌頭從口中一側(cè)拉出，防止手術(shù)中出現(xiàn)窒息。

 

圖2  固定

 4.5    暴露顱骨

按照75%的酒精、碘酒、75%酒精的順序清理待手術(shù)開口處。

使用大手術(shù)剪刀將皮膚剪開，開口的大小由手術(shù)的植入部位及目的來決定。如若對大鼠只進行一次急性記錄（術(shù)后電極取出，大鼠留待他用），可以只將大鼠顱骨上方的皮膚沿著矢狀縫剪開，后起后腦，前至前腦，使用止血鉗將兩側(cè)皮膚撐開。若做電極長期植入記錄，可直接將顱骨上方的皮膚剪去，剪掉的面積不宜過大，可借助止血鉗將開口適當撐開。

 

使用小剪刀將顱骨上的粘膜剪去，用棉簽不斷地稍用力摩擦顱骨表面，充分暴露出硬性骨質(zhì)層，此時可以使用利器輕輕涂刮，使得顱骨表面粗糙以便于牙科水泥的粘連固定，中間適當使用醫(yī)用棉球擦去血跡及其他殘留物。注意：不建議用雙氧水擦拭，刺激性太強，會影響動物神經(jīng)元放電。

 

 4.6    立體定位

顱骨表面充分晾干后會顯現(xiàn)出明顯的矢狀縫（中軸線）、前囟Bregma、后囟Lambda，若記錄部位較小或較深，要求定位精度較高，此時還需對大鼠固定的準確度進行校準。具體操作：在定位儀上方的夾持器上固定一根細棒，將細棒的尖端移動到矢狀縫的前端，往后慢慢移動，若細棒頂端在移動過程中一直在矢狀縫上，且前后距顱骨面高度相近，證明大鼠的頭部固定符合定位要求，否則再進行相應(yīng)的調(diào)整。

以前鹵中心為原點，根據(jù)大鼠腦區(qū)立體圖譜（Paxinos& Watson，第六版）計算所需植入電極位置的坐標，不同大小的大鼠定位應(yīng)按照標準圖譜進行比例換算，另外開口形狀盡量與電極陣列形狀類似，而面積要稍大于電極陣列的橫截面，在擬開口處做上標記。

 

圖4 立體定位

 4.7    鉆孔開口

將顱骨鉆調(diào)至適合轉(zhuǎn)速，并調(diào)對正確轉(zhuǎn)向。在非植入?yún)^(qū)鉆出3-5個孔作為顱釘?shù)墓潭ㄎ恢�，這些位置點盡量均勻分散在顱骨的非植入?yún)^(qū)（若做急性記錄，此步驟省略）。在鉆孔的過程中，應(yīng)一手持電鉆，另手作為支托，使得鉆頭的力量盡量平穩(wěn)，通過間斷性的提起鉆頭可以減少局部高溫，而且這樣更容易感知到鉆頭的實際壓力，避免用力過猛。在下鉆過程中突然出現(xiàn)懸空感時即可停止，將周圍擦凈后就可擰入螺絲釘。在擰螺絲釘時力量不宜過大，且應(yīng)連續(xù)旋轉(zhuǎn)螺絲刀，以避免滑絲。在螺絲釘剛剛穿過顱骨后，但還未擠壓到顱內(nèi)腦膜時就可停止（約0.6-1mm，要結(jié)合具體大鼠體型）。

在植入位置的標記線上進行打磨開顱，在打磨過程中應(yīng)將鉆頭來回地更換位置，以避免產(chǎn)生局部高溫損傷腦組織。在往下打磨中先不要急于鉆透，留下較薄的一層（按壓開口處的顱骨松動無較大阻力），此時將打磨后的顱骨從一側(cè)鉤起（可以使用折彎尖端的注射器針頭，如圖5），利用細鑷子從鉤起的位置將其夾去。最后在顱窗開口處放置一個醫(yī)用棉球，上面用生理鹽水浸濕，用于壓迫止血。顱窗面積大小要稍大于電極陣列的橫截面積（考慮植入中要避開邊緣部分殘存的顱骨）。

 

圖5 尖鉤

 4.8    去除硬腦膜

這一步只針對一部分特制細絲多陣列電極，其他大部分電極可直接穿透硬腦膜。利用尖端折彎的注射器針頭（圖5）在無血管的地方將硬腦膜小心挑破，鉤起一側(cè)，利用鑷子將硬腦膜輕輕揭去。在挑、鉤硬腦膜的過程中一定要避開毛細血管，因為血管的破壞會在一定程度上影響到此區(qū)域神經(jīng)元的活性，而且出血過多會影響手術(shù)植入。最后，在去掉硬腦膜后應(yīng)滴加腦緩沖液(Cortex Buffer)，以維持正常的腦組織環(huán)境。

 

 4.9    電極植入

將電極基座小心地固定在定位儀上的夾持器上，調(diào)整角度，使電極絲的方向與顱骨平面垂直（盡量90°）植入越深，垂直度要求越高，否則植入會有誤差），將其與信號采集系統(tǒng)的輸入端相連，緩慢地將電極靠近顱窗中心，將電極上的地線緊緊纏繞在附近的螺絲釘上，若是要進行慢性實驗，為獲得更好的導(dǎo)電效果可以提前把螺絲釘焊接在地線上，最終固定在顱骨上。在電極絲觸碰到皮層表面時記為深度值的0點，最終緩慢地下降到記錄區(qū)域的位置。若是在手術(shù)中需要長時間的信號采集，可以在顱窗開口滴一滴礦物油，以避免腦組織內(nèi)水分的揮發(fā)。

 

圖6 電極植入

 4.10    牙科水泥固定

利用醫(yī)用棉球?qū)�顱骨面清理干凈并保持干燥，調(diào)制出較稀的牙科水泥，使其自然流進電極陣列的縫隙中，外圍涂上較稠的牙科水泥進行固定，在這個過程中盡量避免牙科水泥與皮膚開口及粘膜的接觸，因為牙科水的刺激性可能會導(dǎo)致大鼠的抖動。在對電極簡單的固定后可以小心地去掉電極的連線及夾持器，最終將整個暴露出的顱骨連同螺絲釘、地線都使用牙科水泥封住。

 

 4.11    術(shù)后恢復(fù)

在大鼠頭部手術(shù)開口及周圍使用碘伏擦拭并涂抹適量的三聯(lián)抗生素，也可注射適量的地塞米松以預(yù)防術(shù)后炎癥，另外，皮下注射適量的卡洛芬可以減小術(shù)后疼痛。最后，將大鼠從定位儀上取出，置于加熱墊上恢復(fù)，直至麻醉藥效消失，可以自主活動，方可放于新的鼠籠內(nèi)單獨飼養(yǎng)。

手術(shù)后三天應(yīng)每天察看手術(shù)后大鼠的狀況，定期進行消炎處理，包括傷口涂抹抗生素，以及注射卡洛芬。