本文要點：前哨淋巴結(jié)成像和活檢對腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床評估很重要，近年來，新型非放射性淋巴示蹤劑一直在積極研究。作者開發(fā)了磷酸化膽堿(PC)配體功能化的金分子簇(Au25)，用于4T1小鼠乳腺癌和CT26結(jié)腸癌小鼠模型的引流淋巴結(jié)的NIR-II (1000-3000 nm)熒光成像。自磷酸化膽堿(Au-PC)探針表現(xiàn)出“超級隱身”的行為，與體內(nèi)的血清蛋白、細(xì)胞和組織很少相互作用，這與吲哚菁綠(ICG)染料不同。皮下注射Au-PC可在注射后0.5 ~ 1小時內(nèi)通過NIR-II熒光成像進(jìn)行淋巴結(jié)定位，隨后可快速被腎臟清除。臨床前NIR-II熒光LN成像具有較高的信底比和較高的安全性和生物相容性，有望在未來的臨床轉(zhuǎn)化。
 

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背景：前哨淋巴結(jié)(SLN)是腫瘤的原發(fā)引流淋巴結(jié)，腫瘤首先發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞從瘤周淋巴管向SLN擴散，然后向遠(yuǎn)處的淋巴結(jié)擴散，開始惡性腫瘤細(xì)胞的淋巴擴散。SLNB活檢(SLNB)是一種標(biāo)準(zhǔn)的癌癥分期方法，包括瘤周給藥放射性同位素、染料示蹤劑或兩者結(jié)合用于SLN的鑒定。SLN通常在10-60分鐘(有時幾個小時)內(nèi)可見，然而，一些危險因素會導(dǎo)致漏檢率為2 - 28%。淋巴閃爍造影的缺點包括缺乏核醫(yī)學(xué)設(shè)施或缺乏獲得放射性藥物的途徑。涉及放射性的操作對醫(yī)護(hù)人員構(gòu)成一定的風(fēng)險。此外，對于某些患者群體(如孕婦)，放射治療通常被排除在外。磷酸膽堿及其衍生物在體外和體內(nèi)具有高度的生物相容性，它對固體表面的非特異性蛋白質(zhì)相互作用具有高抵抗力。由此產(chǎn)生的Au-PC簇被發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)表現(xiàn)為“超隱身”探針，而不與ICG等血清蛋白結(jié)合或像母體Au-GSH簇那樣具有非特異性骨蓄積，從而允許在腫瘤內(nèi)或皮下注射的幾分鐘內(nèi)對小鼠淋巴結(jié)進(jìn)行成像。Au-PC簇在注射部位幾乎沒有保留，并且在24小時內(nèi)從體內(nèi)達(dá)到接近100%的腎臟排泄。我們相信Au-PC分子簇可能是用于NIR-II熒光淋巴結(jié)成像的有希望的探針，供人類在臨床上使用。

 

研究內(nèi)容：作者首先在水相中合成了Au-GSH簇（圖1，a），然后通過EDC / NHS化學(xué)在MES pH 7.0緩沖液中將簇共價地與4-氨基苯基磷酰膽堿（PC）配體共價連接，然后純化以獲得Au-GSH-PC偶聯(lián)物（以下簡稱Au-PC，圖1，b）。Au-GSH簇的后功能化和金-PC共軛結(jié)構(gòu)的示意圖（圖1，b）。水相中Au-GSH簇的紫外可見吸收和熒光光譜（圖1，c）。平均尺寸為1.64納米的金質(zhì)激素簇的冷凍電鏡顯微±0.24納米（n = 3）（圖1，d）。從冷凍電鏡顯微照片獲得的金-GSH簇粒徑分布的描述性統(tǒng)計分析（圖1，e）。Au-GSH簇在負(fù)離子模式下的ESI-MS譜圖譜從m/z 1000到3000：鑒定出5–8個帶負(fù)電荷的物種，其余峰很小，歸因于雜質(zhì)簇/物種。（圖1，f）
 

圖1：Au-GSH簇的表征和功能化

 

之后，作者選擇了靜脈、腫瘤內(nèi)和皮下注射Au-PC、Au-GSH和ICG，活體NIR-II > 1100 nm熒光成像。實驗開始前，作者做了Au-GSH簇和Au-PC偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性試驗和血清蛋白結(jié)合率的實驗。首先是細(xì)胞毒性試驗，在體外條件下，當(dāng)4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞和CT26結(jié)腸癌細(xì)胞以不同質(zhì)量濃度的簇孵育時，在37°C下以1mg / mL，5mg / mL濃度下12小時，作者觀察到Au-GSH和Au-PC簇沒有細(xì)胞毒性。緊接著，作者評估了Au-GSH簇和Au-PC偶聯(lián)物與FBS的血清蛋白結(jié)合能力，并與ICG進(jìn)行了比較。Au-GSH簇、Au-PC偶聯(lián)物和ICG的血清蛋白結(jié)合效率分別為2.7%、1.74%和94.5%。也就是說，大多數(shù)94.5%的ICG被發(fā)現(xiàn)與血清蛋白結(jié)合并且無法通過過濾器。而Au-GSH和Au-PC都顯示出與血清蛋白的相互作用要低得多，尤其是Au-PC。

 

作者隨后做了靜脈中，活體NIR-II > 1100 nm熒光成像。在體內(nèi)，實驗首先通過尾靜脈注射將溶解在PBS中的Au-GSH和Au-PC簇靜脈內(nèi)施用于小鼠（5-7周齡的女性Balb / c，每組n = 3），在>1100nm NIR-II窗口中成像并與臨床批準(zhǔn)的ICG染料并排比較。由于腎臟引流快速腎臟清除的結(jié)果，小鼠的膀胱NIR-II信號在注射后約3分鐘（圖2，a b腹側(cè)視圖）迅速亮起。ICG被證明具有延伸到>1000 nm NIR-II窗口的熒光尾對于靜脈注射ICG，在肝臟和腸道中觀察到強烈的NIR-II信號，與ICG-血清蛋白結(jié)合復(fù)合物形式的膽汁排泄途徑一致65（圖2，c）。注射后24小時后，身體信號被清除，主要器官中沒有顯著的ICG保留。Au-PC和Au-GSH熒光探針后24小時在主要器官中的生物分布（圖2，d e）。來自未經(jīng)治療的小鼠的蘇木精和曙紅（H&E）染色的主要器官的組織學(xué)切片顯示沒有差異，表明靜脈注射的Au-PC探針在體內(nèi)具有很高的安全性。（圖2，f）

圖2：靜脈注射的金-PC，金-GSH和ICG的體內(nèi)熒光成像

 

之后，為了觀察腫瘤內(nèi)，活體NIR-II > 1100 nm熒光成像，作者對攜帶同源4T1小鼠乳腺腫瘤的小鼠（5-7周齡雌性Balb / c，每組n = 3）和接種在后肢上的CT26結(jié)腸腫瘤，施用了幾劑Au-PC探針（圖3a)，引流腹股溝淋巴結(jié)，在約1分鐘內(nèi)開始顯示Au-PC的NIR-II發(fā)射，并在3分鐘內(nèi)達(dá)到高亮度（圖3a）。LN信號在峰值30分鐘達(dá)到峰值強度后，在排水iLNs中持續(xù)超過1小時（圖3a），LN/背景信號比〜5-10（圖3d）。10分鐘內(nèi)，作者觀察到淋巴管中的Au-PC 在NIR-II發(fā)射，從iLNs到達(dá)腋窩區(qū)域，并弱標(biāo)記4T1和CT26小鼠模型的腋窩LN（aLN）。信號在Au-PC探頭的30分鐘后完全消失。

圖3：腫瘤內(nèi)注射的金-PC，金-GSH和ICG的體內(nèi)熒光成像

 

作者將Au-PC和Au-GSH探針相比，觀察到ICG表現(xiàn)出截然不同的SLN引流動力學(xué)（圖3c）。ICG信號首次出現(xiàn)在SLN中的時間比Au-PC和Au-GSH的次數(shù)長，并且因小鼠而異，在內(nèi)側(cè)注射后10分鐘-30分鐘的范圍內(nèi)注射到4T1腫瘤中。與靜脈注射病例類似，腫瘤內(nèi)注射的Au-PC和Au-GSH探針通過腎臟途徑從體內(nèi)排泄出來（圖4），而ICG通過肝臟排泄系統(tǒng)排出。在24小時內(nèi)，對排泄物的ICP-MS分析顯示，約92%的注射Au-PC樣品通過尿液排泄（圖4a，b），而用Au-GSH觀察到僅38%的尿排泄（圖4c，d）。對于Au-PC探針（圖3a），觀察到來自腫瘤注射部位和小鼠身體的接近完全的信號褪色24小時（圖3a），同時在腫瘤注射部位仍然檢測到Au-GSH（圖3b）和ICG探針（圖3c）的顯著信號。與ICG和Au-GSH相比，Au-PC簇在注射部位和體內(nèi)表現(xiàn)出最小的捕獲和保留，這表明Au簇的高度隱身性歸因于表面磷酸膽堿配體賦予最小的相互作用以及與體內(nèi)蛋白質(zhì)，細(xì)胞和組織/器官的非特異性結(jié)合。

圖4：腫瘤內(nèi)注射Au-PC和Au-GSH后的排泄曲線和生物分布

 

接下來，為了比較腫瘤內(nèi)注射Au-PC和Au-GSH后的代謝和分布，作者在小鼠尾巴基部注射三個探針后LN引流（5-7周齡的女性Balb / c，每組n = 3）。在3分鐘內(nèi)的Au-PC簇遷移到連接注射部位和引流iLN的淋巴管（圖5a）。iLN中的強信號在長達(dá)1小時內(nèi)可見，并且在2小時時降低約40%（圖5d）。在24小時內(nèi)，Au-PC信號從體內(nèi)消失，在注射部位幾乎沒有保留。在注射的Au-GSH簇的情況下，iLN中的信號在30分鐘達(dá)到峰值，2小時減少〜50%，并且在24小時時大部分從注射部位消失，但在中央骨骼框架中觀察到顯著信號（圖5b，e）。在24小時內(nèi)，ICP-MS分析顯示，注射的Au-PC樣品的約92%通過尿液排泄，而用Au-GSH觀察到〜71%的尿液排泄。相反，在IGG給藥時（圖5c），iLN中的熒光信號出現(xiàn)3分鐘，但與注射后同時使用Au-PC探針的強度相比要低得多（圖5f）。在2-3 h后（甚至更晚），iLN中的ICG信號達(dá)到峰值強度并持續(xù)存在。即使在24小時后，顯著信號仍然保留在淋巴結(jié)，注射部位和肝臟中（圖5f）。ICG在注射部位的保留持續(xù)了很長一段時間（圖5F），比Au-PC長得多。

圖5：皮下注射金質(zhì)PC，金-GSH和ICG的體內(nèi)熒光成像

 

為了比較Au-PC和ICG 探針在各種NIR子窗口中進(jìn)行淋巴結(jié)成像，作者進(jìn)行了1倍劑量的Au-PC（圖6a）和ICG（圖6b）（5-7周齡的女性Balb / c，每組n = 3）的腫瘤內(nèi)注射，并通過檢測探針的NIR-II發(fā)射（在相同的808nm激發(fā)下）來比較LN成像在各自峰值強度時間點的引流iLN中增加波長。我們分析了基于Au-PC和ICG的LN成像在>900 nm，>1100 nm，>1200 nm和>1300 nm發(fā)射窗口下的全寬半最大值（FWHM）（圖6C）。隨著發(fā)射波長的增加，橫截面輪廓的增寬明顯減小，淋巴結(jié)半最大值（FWHM）的實測全寬從3.8、3.5、3.2mm下降到2.8 mm（圖6c），表明在較長時間發(fā)射時成像分辨率增加。LN/B 比值也有所增加，并為 Au-PC 提供了更高的 LN/B 比，特別是在 >1300 nm 成像范圍內(nèi)（圖 6d）。在>1300 nm發(fā)射下測量的Au-PC的LN/B比值達(dá)到~22（圖6d），可以清晰地識別/成像主層節(jié)點。

圖6：各種NIR子窗口中的淋巴結(jié)成像

 

總結(jié)：本文研究了具有NIR-II熒光的分子金納米簇，用于同源4T1小鼠乳腺和CT26腫瘤小鼠模型中的SLN檢測和定位。在水溶液中合成提供了L-谷胱甘肽包被的Au簇，并且與磷酸膽堿配體（Au-PC）的進(jìn)一步功能化導(dǎo)致了高度生物相容的“隱形”NIR-II探針。由于磷酸膽堿配體是生命系統(tǒng)固有的安全生物分子，Au-PC分子簇在體內(nèi)表現(xiàn)出“超隱身”行為方面是獨一無二的，與蛋白質(zhì)，細(xì)胞和組織的相互作用/結(jié)合可以忽略不計，并且通過尿液排泄，無論注射途徑如何（靜脈注射， 腫瘤內(nèi)或皮下注射）。i.t.和s.c.注射的Au-PC在幾分鐘到幾小時內(nèi)迅速遷移到引流淋巴結(jié)。腫瘤內(nèi)給藥后Au-PC的LN引流藥代動力學(xué)進(jìn)入4T1腫瘤和CT26腫瘤的小鼠，在~1 min內(nèi)到達(dá)引流腹股溝淋巴結(jié)，并以峰值強度持續(xù)30 min~1 h，在后期時間點逐漸消退。Au-PC探頭允許在注射后幾乎立即排出LN成像，并提供〜1-2小時的成像窗口。Au-PC和ICG都表現(xiàn)出1000-1400范圍內(nèi)的NIR-II熒光，低發(fā)射尾部>1300 nm。>1300 nm范圍內(nèi)的成像在穿透深度、信號/背景和圖像清晰度方面是最佳的，但需要更長的曝光時間（約400 ms）。Au簇（Au-PC和 Au-GSH）沒有擴散和非特異性結(jié)合行為，允許對dLNs進(jìn)行更清晰，更有針對性的成像。這一重要特性將Au分子簇與菁染料區(qū)分開來，并被報道為減緩正常血管簇外滲并增強其對癌組織的靶向的方法。

 

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1038/s41467-022-33341-6

 

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