先天性膽道閉鎖（BA）是一種常見的高致死率新生兒疾病，因膽管狹窄或阻塞而導(dǎo)致膽汁在肝臟內(nèi)淤積，引起不可逆的肝臟損傷。通過手術(shù)可緩解膽汁淤積癥狀，但約有一半嬰兒會繼續(xù)出現(xiàn)肝病惡化，最終需要進(jìn)行肝移植。膽道閉鎖的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但中性粒細(xì)胞被認(rèn)為在疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用。

最近，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心的研究團(tuán)隊深入分析了CD177⁺中性粒細(xì)胞在膽道閉鎖發(fā)病機(jī)制中的作用，發(fā)現(xiàn)CD177⁺細(xì)胞通過形成胞外誘捕網(wǎng)（NET）而在膽管上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

這篇題為“CD177⁺ cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia”的文章于7月發(fā)表在肝病學(xué)權(quán)威雜志《Journal of Hepatology》上。
 

 

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了BALB/c小鼠和NOD/SCID小鼠，并委托賽業(yè)生物構(gòu)建了Cd177基因敲除（Cd177^-/-）小鼠。作者采用單細(xì)胞RNA測序和Smart-Seq RNA測序方法獲得了多個細(xì)胞的基因表達(dá)譜，并通過膽管造影術(shù)和組織切片染色等分析小鼠的膽管阻塞和肝臟損傷，同時還開展了一項初步的臨床試驗，以確定N-乙酰半胱氨酸對CD177⁺細(xì)胞積累和NET形成的影響。

技術(shù)路線
01建立膽道閉鎖小鼠模型并鑒定Gr-1⁺細(xì)胞的主要成分
02構(gòu)建Cd177基因敲除小鼠以明確CD177⁺細(xì)胞在膽道閉鎖中的功能
03采用Smart-Seq RNA測序方法分析CD177⁺細(xì)胞的基因表達(dá)譜
04確定CD177⁺細(xì)胞通過形成NET而促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞凋亡
05分析NAC在膽道閉鎖治療中的安全性和有效性

研究結(jié)果
1.CD177⁺細(xì)胞在膽道閉鎖患者中積累
之前的研究顯示中性粒細(xì)胞在膽道閉鎖患者的膽管周圍積累，而且在小鼠疾病模型中，Gr-1⁺（中性粒細(xì)胞標(biāo)志物）細(xì)胞的去除阻止了疾病的發(fā)生，表明中性粒細(xì)胞可能具有病理作用。由于Gr-1⁺細(xì)胞是一個混合群體，故需要進(jìn)一步分析來明確各個成分的具體作用。

研究人員采用缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的NOD/SCID小鼠，通過腹腔注射恒河猴輪狀病毒（RRV）構(gòu)建出膽道閉鎖小鼠模型。作者發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RRV組小鼠肝臟中的Gr-1⁺細(xì)胞升高，表明Gr-1⁺細(xì)胞可能是對病毒感染做出應(yīng)答并介導(dǎo)膽管損傷的主要先天免疫細(xì)胞群。

作者接著用單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）技術(shù)分析了該群Gr-1⁺細(xì)胞的組成�；�因表達(dá)譜顯示細(xì)胞表面分子CD177在Gr-1⁺細(xì)胞群中高表達(dá)，表明CD177⁺細(xì)胞是Gr-1⁺細(xì)胞的主要功能亞群，同時干擾素刺激相關(guān)基因和中性粒細(xì)胞脫顆粒相關(guān)基因的表達(dá)也顯著上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，在新生小鼠感染RRV后，CD177⁺細(xì)胞被激活并表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗病毒反應(yīng)。作者還發(fā)現(xiàn)，膽道閉鎖患者外周血和肝臟活檢樣本中的CD177⁺細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組。

為了進(jìn)一步確定CD177⁺細(xì)胞在膽道閉鎖中的功能，研究人員委托賽業(yè)生物構(gòu)建了Cd177基因敲除（Cd177^-/-）小鼠，并與野生型小鼠進(jìn)行了比較。與對照組相比，Cd177^-/-小鼠表現(xiàn)出疾病發(fā)作延遲以及發(fā)病率和死亡率降低。膽管造影顯示Cd177^-/-小鼠的肝外膽管沒有阻塞。這些結(jié)果顯示CD177⁺細(xì)胞在小鼠膽道閉鎖的發(fā)病機(jī)制中起主要作用。

2.CD177⁺細(xì)胞通過NET促進(jìn)BEC凋亡
之后，作者又采用Smart-Seq RNA測序方法分析了CD177⁺細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)BA患者來源的CD177⁺細(xì)胞中與線粒體和中性粒細(xì)胞相關(guān)的信號通路是兩條主要的上調(diào)通路。值得一提的是，參與氧化磷酸化和氧化應(yīng)激基因表達(dá)的上調(diào)，表明線粒體功能的激活與CD177⁺細(xì)胞的強(qiáng)大免疫功能之間存在密切關(guān)聯(lián)。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，CD177⁺細(xì)胞的積累與多種自身免疫性疾病有關(guān)。不過，當(dāng)炎癥性腸病發(fā)生時，CD177⁺細(xì)胞通過釋放IL-22和胞外誘捕網(wǎng)（NET）發(fā)揮保護(hù)作用。NET是由染色質(zhì)DNA和多種效應(yīng)蛋白組成的3D結(jié)構(gòu)，可以捕獲和殺死病原體，也可能導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷。

研究人員發(fā)現(xiàn)，分離自膽道閉鎖患者的CD177⁺細(xì)胞與膽管上皮細(xì)胞（BEC）共培養(yǎng)時會誘導(dǎo)后者凋亡；而將不同的NET抑制劑添加到CD177⁺細(xì)胞培養(yǎng)物中，收集上清液并作為條件培養(yǎng)基添加到膽管上皮細(xì)胞中，則發(fā)現(xiàn)NET抑制劑可減少膽管上皮細(xì)胞凋亡（圖1）。這些結(jié)果表明，在膽道閉鎖發(fā)生時，CD177⁺細(xì)胞可通過釋放NET誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞凋亡。
 

圖1 膽道閉鎖患者的CD177⁺細(xì)胞通過NET促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞凋亡
 

總的來說，這項研究解析了先天免疫在膽道閉鎖形成中的作用。CD177⁺細(xì)胞通過NET形成和線粒體積累來誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞損傷，而N-乙酰半胱氨酸治療可降低CD177⁺細(xì)胞數(shù)量和活性氧水平從而抑制NET形成，有助于膽道閉鎖的管理。

原文檢索：

Zhang R, Su L, Fu M, et al. CD177+ cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia. J Hepatol. 2022 Jul 5:S0168-8278(22)00409-3. doi: 10.1016/j.jhep.2022.06.015.

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