人類基因組中的變異和人類的演化、疾病風(fēng)險(xiǎn)等方面都有著密切的聯(lián)系。基因組變異主要包括單核苷酸突變、插入缺失和結(jié)構(gòu)變異三大類。而受技術(shù)限制，結(jié)構(gòu)變異分析仍然是一大塊“神秘土地”，齊碳通過總結(jié)近幾年人類基因組結(jié)構(gòu)變異相關(guān)的研究成果，與大家分享目前基于納米孔測(cè)序技術(shù)長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的結(jié)構(gòu)變異測(cè)序與分析方法，為更好地從群體及個(gè)體角度解析結(jié)構(gòu)變異提供新思路。
  結(jié)構(gòu)變異（Structural variation, SV）是指序列長(zhǎng)度大于50 bp的基因組序列變化，可以分為缺失（Deletion）、插入（Insertion）、重復(fù)（Duplication）、倒位（Inversion）和易位（Translocation）以及復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異等。其中，缺失和重復(fù)事件也稱為拷貝數(shù)變異（Copy number variation/alteration, CNV/CNA）。  
值得一提的是，在人類基因組中，結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量雖然遠(yuǎn)少于單核苷酸變異（Single-nucleotide variant，SNV）的數(shù)量（表1），但研究發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)變異對(duì)基因組的影響卻更大。這是由于DNA序列變化越大，其有害性通常也越大。
 
如表1所示，人類基因組結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量約占SNV數(shù)量的0.5%，但受結(jié)構(gòu)變異影響的堿基數(shù)卻是SNV總和的10倍之多。與SNV相比，大片段結(jié)構(gòu)變異與全基因組關(guān)聯(lián)信號(hào)相關(guān)的可能性高出3倍，影響基因表達(dá)的可能性則達(dá)30倍以上。
  隨著結(jié)構(gòu)變異成為越來越多研究關(guān)注的熱點(diǎn)，目前主要檢測(cè)方法呈現(xiàn)多樣化。但由于技術(shù)限制，如何更準(zhǔn)確檢測(cè)大片段結(jié)構(gòu)變異（如拷貝數(shù)變異、大片段InDel、染色體倒位、染色體內(nèi)部或染色體之間的序列易位等）依然充滿挑戰(zhàn)。
相比于其他檢測(cè)技術(shù)，三代測(cè)序發(fā)揮長(zhǎng)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)可跨越基因組中大片段結(jié)構(gòu)變異，為結(jié)構(gòu)變異的準(zhǔn)確分析提供了新平臺(tái)。
一方面，三代測(cè)序技術(shù)有效增加了結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)的數(shù)量和類型，例如復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異、串聯(lián)重復(fù)和轉(zhuǎn)座元件插入等；另一方面，可以幫助獲取結(jié)構(gòu)變異更完整的信息，例如斷點(diǎn)位置和完整的變異序列等。    
納米孔測(cè)序檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異的方法可分為全基因組納米孔測(cè)序和目標(biāo)區(qū)域納米孔測(cè)序。 全基因組納米孔測(cè)序可以全面檢測(cè)基因組中發(fā)生的結(jié)構(gòu)變異，但通常所需數(shù)據(jù)量較大，例如能夠檢測(cè)到人類樣本約在15x測(cè)序深度下的可靠胚系結(jié)構(gòu)變異。
2020年，針對(duì)3622個(gè)冰島人樣本進(jìn)行全基因組納米孔測(cè)序（深度：~17.2x）揭示了冰島人群結(jié)構(gòu)變異特征，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)與LDL膽固醇和身高等性狀相關(guān)的基因結(jié)構(gòu)變異^[4]。
2021年，另一篇針對(duì)405個(gè)中國(guó)人樣本的全基因組納米孔測(cè)序研究（深度：~17x），將檢測(cè)到的結(jié)構(gòu)變異與其臨床性狀（生化、血液和血清成分等指標(biāo)）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)14號(hào)染色體的22個(gè)SV事件與13個(gè)表型呈顯著相關(guān)。研究還揭示了中國(guó)南北方人在免疫相關(guān)基因上面臨著不同的選擇壓力^[5]。   目標(biāo)區(qū)域納米孔測(cè)序則是僅對(duì)獲取的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序，研究針對(duì)性強(qiáng)且所需數(shù)據(jù)量少。獲取目標(biāo)區(qū)域序列方式是多樣化的，包含PCR擴(kuò)增、探針捕獲和Cas9富集。PCR擴(kuò)增和探針捕獲方式獲取的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序深度較高，但在擴(kuò)增過程中往往無法保留堿基的修飾信息；而Cas9富集測(cè)序的目標(biāo)區(qū)域深度波動(dòng)范圍較大，但可以相對(duì)完整地保留堿基修飾信息。
一項(xiàng)對(duì)林奇綜合征的研究，通過探針捕獲相關(guān)基因全長(zhǎng)序列和納米孔測(cè)序（深度：~1000x），能夠檢測(cè)到MLH1和MSH2基因上的缺失或重復(fù)事件^[6]；另一項(xiàng)研究利用PCR對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤病人RB1基因的序列擴(kuò)增和納米孔測(cè)序，檢測(cè)到RB1基因exon23缺失，并在缺失位置檢測(cè)到85bp的插入序列^[7]。   由于測(cè)序數(shù)據(jù)前期可以采用比對(duì)法或組裝法處理，使得結(jié)構(gòu)變異分析方法也有所不同。
·基于比對(duì)法主要利用比對(duì)到斷點(diǎn)位置的Split reads識(shí)別結(jié)構(gòu)變異，即一條read被分割成多個(gè)區(qū)域比對(duì)在參考基因組不同位置。該方法常用的檢測(cè)軟件如表2所示。
 ·基于組裝法是先對(duì)個(gè)體基因組組裝，再比較組裝后的基因組和參考基因組的差異分析結(jié)構(gòu)變異。 支持?jǐn)?shù)據(jù)僅為研究文章所用數(shù)據(jù)
 
相關(guān)文章基于納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)Snifffles、cuteSV、pbsv、NanoVar、NanoSV和SVIM等分析軟件進(jìn)行測(cè)評(píng)。
 
利用數(shù)據(jù)模擬軟件得到含24600個(gè)SVs的納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)已檢測(cè)出的結(jié)構(gòu)變異的位置、長(zhǎng)度、類型和基因型信息進(jìn)行軟件表現(xiàn)評(píng)估。結(jié)果顯示：測(cè)序深度超過20x后（10x、20x、30x和50x），以上軟件檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)數(shù)量的增速均有所減緩。其中，cuteSV的綜合表現(xiàn)較為穩(wěn)定。
  combiSV(6): 整合6個(gè)軟件檢測(cè)結(jié)果
perfect matches代表檢測(cè)到SV的類型、基因型、完整的長(zhǎng)度和位置均正確
 
中國(guó)人群大規(guī)模結(jié)構(gòu)變異的研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到15x ，若繼續(xù)增加測(cè)序深度，結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)數(shù)量將逐漸趨于穩(wěn)定。 左：HG002在不同深度（8~40x）和軟件下檢測(cè)SV的數(shù)量；Combine代表兩個(gè)軟件交集結(jié)果
右：利用sniffles檢測(cè)3622個(gè)冰島人結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量；每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)個(gè)體的測(cè)序深度和檢測(cè)SV數(shù)量
 
由此可見，納米孔測(cè)序檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異的測(cè)序方法和分析方法是多樣化的。而在實(shí)際研究應(yīng)用中，挖掘基因組結(jié)構(gòu)變異硬實(shí)力（技術(shù)平臺(tái)）和軟實(shí)力（數(shù)據(jù)算法）缺一不可，隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷成熟和軟件算法的不斷進(jìn)步，研究者可以根據(jù)自己的研究目的、數(shù)據(jù)特征和軟件檢測(cè)力選擇合適的檢測(cè)技術(shù)，或者通過不同技術(shù)組合和不同算法組合從而達(dá)到增效作用。
 
參考資料：
[1] van Belzen IAEM, Schönhuth A, Kemmeren P, Hehir-Kwa JY. Structural variant detection in cancer genomes: computational challenges and perspectives for precision oncology. NPJ Precis Oncol. 2021. 2;5(1):15.
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[4] Beyter D, Ingimundardottir H, Oddsson A, et al. Long-read sequencing of 3,622 Icelanders provides insight into the role of structural variants in human diseases and other traits. Nat Genet. 2021. 53(6):779-786.
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[8] Dierckxsens N, Li T, Vermeesch JR, Xie Z. A benchmark of structural variation detection by long reads through a realistic simulated model. Genome Biol. 2021. 15;22(1):342. 2021年12月，齊碳科技通過5年的自主研發(fā)，成功推出國(guó)內(nèi)首臺(tái)商業(yè)化的納米孔基因測(cè)序儀QNome-3841，并宣布首個(gè)生產(chǎn)基地竣工，正式開啟納米孔基因測(cè)序國(guó)產(chǎn)化時(shí)代。2022年6月，齊碳科技發(fā)布納米孔基因測(cè)序儀QNome-3841hex，標(biāo)志著國(guó)產(chǎn)納米孔基因測(cè)序儀開始了矩陣化發(fā)展，這也為靈活測(cè)序場(chǎng)景提供全新的解決方案，將更好地滿足市場(chǎng)應(yīng)用的多元需求。 齊碳秉承從上游推動(dòng)行業(yè)發(fā)展的理念和對(duì)前沿技術(shù)的探索精神，保持開放、合作的態(tài)度，期待和產(chǎn)業(yè)同仁攜手共進(jìn)，探索國(guó)產(chǎn)納米孔基因測(cè)序技術(shù)在多場(chǎng)景中的優(yōu)勢(shì)和廣闊的市場(chǎng)前景，構(gòu)建納米孔基因測(cè)序的生態(tài)平臺(tái)，共同為中國(guó)醫(yī)療健康事業(yè)的穩(wěn)健發(fā)展貢獻(xiàn)智慧和力量。