導(dǎo)論
乳糖操縱子（ lacO）是一組埃希氏菌屬大腸桿菌基因，負(fù)責(zé)細(xì)菌中的乳糖代謝。乳糖阻遏物對它的調(diào)控是分子生物學(xué)中一個研究較為充分的系統(tǒng)。DNA 結(jié)合蛋白（ lacI）是控制乳糖操縱子的關(guān)鍵因子。該系統(tǒng)的平衡解離常數(shù)（  K_D）通常估計在 nM 范圍內(nèi)。

在這篇應(yīng)用筆記中我們將分享蒙特利爾大學(xué)實驗室如何使用 P4SPR 來確定 lacO / lacI 系統(tǒng)的結(jié)合強度（親和力， K_D）。實驗室技術(shù)人員通過易用的 P4SPR 和相應(yīng)的用戶界面來開發(fā) SPR分析，以便在本科實驗課程中演示該生物系統(tǒng)。
 

圖 1：乳糖操縱子與乳糖阻遏蛋白結(jié)合

實驗過程

系統(tǒng)設(shè)置

圖 2：臺式 P4SPR 設(shè)置

USB 供電的 P4SPR 可以連接到筆記本電腦，通過 P4SPR控制軟件啟動操作和數(shù)據(jù)記錄。易于使用的界面讓用戶可以輕松設(shè)置 P4SPR。首先，把微流體單元（圖3）蓋在金傳感器芯片上并緊密固定在傳感器芯片腔中。然后在樣品和參比通道中注入溶液以穩(wěn)定基線。S形樣品通道具有 3 個平行的感應(yīng)區(qū)域，其可以提供三個重復(fù)樣品的測量以及與一個參考通道的控制測量。通過透明通道可以直接觀察在通道中是否有氣泡行成，以便立即清除從而防止任何信號丟失。
 

圖 3：P4SPR 微流體單元

實驗步驟

圖 4：實驗流程圖

在達(dá)到基線穩(wěn)定后，將硫醇化的 LacO DNA 注入樣品通道。形成強金-硫鍵后， 當(dāng) SPR 表面飽和后產(chǎn)生平臺信號。然后注射互補的 LacO 寡聚體進(jìn)行雜交。在結(jié)合測定之前徹底洗滌傳感器表面。通過先前儲備的蛋白母液來制備 5, 20, 50, 100 和 200nM 的蛋白分析物溶液。依次注入逐漸增加濃度的溶液，并用大量洗滌溶液和再生緩沖液孵化 10 分鐘， 用于除去剩余的 LacI 蛋白。記錄來自所有 4 個通道的數(shù)據(jù)，然后導(dǎo)出到 Excel 中進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。

結(jié)果和討論
在該實驗中，從樣品通道得到 3 條平行結(jié)合曲線。對該信號進(jìn)行平均后，從參考通道信號中減去來得到 SPR 信號相對于時間的信號圖（圖 5）。使用不同濃度的結(jié)合位移來建立結(jié)合等溫線，從而確定 K_D（圖 6）。計算的  K_D為 6.4± 1.2nM，符合相關(guān)低濃度基于 LacI 的轉(zhuǎn)錄抑制蛋白的文獻(xiàn)報道值¹。值得注意的是，與已發(fā)表論文中使用的 DNA 結(jié)合分析相比， SPR 分析不需要任何 DNA 放射性標(biāo)記，并且可實時監(jiān)測。

圖 5：關(guān)于不同濃度的 LacO 隨時間變化的 SPR 信號
 

圖 6：疊加 Lacl 濃度增加的結(jié)合曲線

P4SPR 優(yōu)勢
P4SPR 獨特的模塊式， 便攜和多通道設(shè)計使其成為用于藥物發(fā)現(xiàn)，生物/傳感和系統(tǒng)集成應(yīng)用的靈活臺式 SPR工具。它幾乎不需要樣品制備，使得系統(tǒng)設(shè)置快速簡單，同時節(jié)省了用戶在純化試劑盒和試劑上的成本。此外， P4SPR 利用薄膜 SPR 的高靈敏度和更深的穿透深度來準(zhǔn)確測量結(jié)合的親和力。

總結(jié)
P4SPR 成功地檢測乳糖操縱子 DNA 與其阻遏蛋白的結(jié)合相互作用，并且數(shù)據(jù)可通過之前發(fā)表的文獻(xiàn)驗證。本科生可從該實驗熟悉 SPR 技術(shù)及其在監(jiān)測生物分子相互作用中的應(yīng)用。此外， P4SPR 系統(tǒng)也可研究其他生物系統(tǒng)，如 DNA-DNA， RNA 以及適體對，可以幫助科研人員更好地了解結(jié)合作用并揭示其在生物系統(tǒng)中的功能。

致謝
我們要感謝 Philipe Lampron， Shona Teijeiro 和蒙特利爾生物化學(xué)大學(xué)的 Sébastien Truche 開發(fā)該技術(shù)。

關(guān)于 Affinité Instruments
Affinité Instruments 是一個從蒙特利爾大學(xué)衍生的企業(yè)。Affinité Instruments 的創(chuàng)始人在 SPR 領(lǐng)域積累了十多年豐富的研究經(jīng)驗，并通過多元化的商業(yè)，科學(xué)和工程領(lǐng)域經(jīng)驗將創(chuàng)新的 SPR技術(shù)商業(yè)化。

¹Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities ofengineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation.

doi: https://doi.org/10.1101/477893