本文要點(diǎn)：近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ）窗口的熒光生物成像可以提供具有低背景信號(hào)的精確圖像。根據(jù)單體的固有發(fā)射，實(shí)現(xiàn)有機(jī)熒光團(tuán)的吸收/發(fā)射波長(zhǎng)超過1300 nm是具有挑戰(zhàn)性的工作。減少聚集熒光淬滅（ACQ）效應(yīng)是在理想?yún)^(qū)域?qū)崿F(xiàn)熒光生物成像的有效策略。本文報(bào)道了兩個(gè)在相同骨架上具有不同側(cè)鏈的NIR-Ⅱ氧雜蒽熒光團(tuán)（CM1和CM2），及其相應(yīng)的組件CM1 NPs和CM2 NPs。其中CM2 NPs顯示出ACQ效應(yīng)的顯著降低，最大吸收/發(fā)射波長(zhǎng)拓展至1235/1250 nm。CM2 NPs可以高分辨率區(qū)分鄰近的動(dòng)脈與靜脈，并且可以實(shí)現(xiàn)超過1300 nm的血管造影，分辨小至0.23 mm的毛細(xì)血管。
 

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近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ，1000 -1700 nm）窗口的熒光生物成像具有高靈敏度、深穿透深度（~ 1.5 cm）和高成像質(zhì)量與對(duì)比度等優(yōu)良性質(zhì),近幾年得到飛速發(fā)展。開發(fā)具有足夠亮度的NIR-Ⅱ熒光團(tuán)對(duì)于更先進(jìn)的NIR-Ⅱ生物成像至關(guān)重要。目前已開發(fā)的NIR-Ⅱ有機(jī)熒光團(tuán)主要包括聚亞甲基、苯并噻二唑衍生物、氧雜蒽衍生物、BODIPY衍生物等。廣泛拓展π共軛結(jié)是將吸收/發(fā)射波長(zhǎng)紅移到NIR-Ⅱ窗口的一種有效策略，但由此帶來了結(jié)構(gòu)優(yōu)化的挑戰(zhàn)。1）長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光燃料由于其最高占據(jù)分子軌道（HOMO）能級(jí)高而通常不穩(wěn)定且易被氧化。2）由于其表面疏水性，大的π共軛染料容易形成H-聚集體和遭受ACQ效應(yīng)。因此，該策略并不適用于通過靜脈注射進(jìn)行明亮精細(xì)的熒光成像。為了減少H-聚集體導(dǎo)致的ACQ效應(yīng)，J-聚集體和聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）物質(zhì)被廣泛使用。然而，這些策略仍受到復(fù)雜的制備過程和低于1200 nm的本征發(fā)射的限制。

本文合成了兩個(gè)在相同骨架上具有不同側(cè)鏈的NIR-Ⅱ氧雜蒽染料（CM1和CM2），采用兩親聚合物F127封裝它們來制備水分散的納米粒子，再通過經(jīng)典乳化方法制備了兩個(gè)組件CM1 NPs和CM2 NPs。CM1 NPs顯示出明顯的ACQ效應(yīng)且熒光較弱，而CM2 NPs表現(xiàn)出降低的ACQ效應(yīng)及明亮的熒光，且最大吸收/發(fā)射波長(zhǎng)擴(kuò)展到1235/1350 nm。靜脈注射CM2 NPs后可以觀察到明亮的后肢脈管系統(tǒng)，甚至可以區(qū)分鄰近的動(dòng)脈和靜脈。此外，具有低背景信號(hào)的CM2 NPs可實(shí)現(xiàn)超過1300 nm的血管造影。（Figure 1）

Figure 1

 

作者首先完成了CM1和CM2分子的制備及表征。通過將兩個(gè)氧雜蒽核與花青染料橋聯(lián)得到NIR-Ⅱ氧雜蒽染料核心CL1，隨后CL1與硫醇進(jìn)行經(jīng)典親核取代反應(yīng)合成CM1和CM2（CM1 : 3,5 -雙（三氟甲基）苯硫醇；CM2 ：2- （4-巰基對(duì)苯基）乙酸）（Figure 2a）。隨后對(duì)其光物理性質(zhì)進(jìn)行了考察。CM1和CM2在NIR-Ⅱ區(qū)域都表現(xiàn)出較長(zhǎng)的吸收/發(fā)射波長(zhǎng)，在氯仿中的最大吸收/發(fā)射波長(zhǎng)分別為1180/1220 nm和1160/1200 nm；CM1和CM2的摩爾吸光系數(shù)分別約為26800和31300 M-1cm-1，計(jì)算出CM1和CM2的熒光量子產(chǎn)率為0.70 × 10-4和0.76 × 10-4（Figure 2b和Table 1）。作者還以市售的吲哚菁綠（ICG）和IR 1061染料為參考，對(duì)CM1 NPs和CM2 NPs的光穩(wěn)定性進(jìn)行了探索，由于分子剛性更大，CM1和CM2在1064 nm照射下的光穩(wěn)定性與IR 1061相當(dāng)，而ICG在808 nm的光照射下迅速漂白（Figure 2c）。

Figure 2

 

Table 1

作者接著完成了CM1 NPs 和CM2 NPs的制備并對(duì)其表征。采用兩親聚合物F127包封CM1和CM2賦予染料用于靜脈注射的親水性，采用經(jīng)典乳化方法制備兩種水分散的納米顆粒CM1 NPs 和CM2 NPs（Figure 3a）。由透射電子顯微鏡（TEM）圖像得到其平均納米顆粒尺寸為50和30 nm，由動(dòng)態(tài)光散射（DLS）得到其流體動(dòng)力學(xué)尺寸為126和100 nm（Figure 3b和c），流體動(dòng)力學(xué)尺寸略大于TEM中的顆粒尺寸來源于水化層的包裹。此外，CM1 NPs 和CM2 NPs在Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）和胎牛血清（FBS）中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。作者進(jìn)一步檢查它們的吸收和發(fā)射光譜發(fā)現(xiàn)，CM1 NPs表現(xiàn)出典型的H-聚集現(xiàn)象，最大吸收波長(zhǎng)為790 nm（Figure 3d），猜測(cè)CM1 NPs的弱熒光強(qiáng)度來源于由H-聚集體導(dǎo)致的ACQ效應(yīng)，與之相反，由于ACQ效應(yīng)的顯著降低，CM2 NPs比CM1 NPs表現(xiàn)出更高的熒光強(qiáng)度，最大吸收波長(zhǎng)為1235/1250 nm（Figure 3e）。作者計(jì)算出，分散在水中的CM1 NPs和CM2 NPs的熒光量子產(chǎn)率分別為0.01 × 10-4和0.15 × 10-4。通過體外NIR-Ⅱ熒光成像，作者發(fā)現(xiàn)CM2 NPs通過1150和1300長(zhǎng)通（LP）過濾器表現(xiàn)出明顯的熒光信號(hào)，而CM1 NPs則幾乎沒有熒光信號(hào)。此外，CM2 NPs在pH 4-9范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的pH穩(wěn)定性。由此可見，CM2 NPs可用于1300 nm以上的NIR-Ⅱ熒光成像。

Figure 3

 

作者接著對(duì)CM2 NPs減少ACQ效應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行探究。首先借助MD模擬來幫助理解分子間堆疊方式降低ACQ效應(yīng)的機(jī)制（Figure 4a），如Figure 4b（側(cè)視圖）和4c（頂視圖）所示，CM2表現(xiàn)出高度扭曲的行為，避免了形成具有龐大平面結(jié)構(gòu)的H-聚集體。將CM2分成三個(gè)部分來測(cè)量?jī)蓚�(gè)相鄰分子的分子間距離，如Figure 4b所示，CM2的巰基部分命名為1，兩點(diǎn)的氧雜蒽核分別命名為2和3，相鄰分子的相應(yīng)三個(gè)部分分別命名為1’、2’和3’。如Figure 4d所示，兩個(gè)相鄰的CM2分子的羧基在2.8 Å的距離處形成氫鍵。兩個(gè)相鄰分子的秋季垂直距離為3.5 Å，滑動(dòng)角為46.8°。兩個(gè)相鄰CM2分子的氧雜蒽核2與2’間的垂直距離為4.0 Å，滑動(dòng)角為46.7°，表現(xiàn)為π-π折疊行為（Figure 4e）。值得注意的是，這兩個(gè)部分的滑動(dòng)角幾乎相等，均小于J-聚集體的臨界值54.7°。而如Figure 4f所示，兩個(gè)相鄰CM2分子的氧雜蒽核3與3’之間的垂直距離為3.7 Å，呈邊對(duì)面堆疊方式。這種典型的CH-π相互作用有助于形成更穩(wěn)定的組裝體并延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)。作者由此提出，側(cè)鏈工程驅(qū)動(dòng)的氫鍵、π-π相互作用及CH-π相互作用降低了CM2的ACQ效應(yīng)。

 

作為比較，作者還通過MD模擬探索了CM1 NPs的分子間堆疊方式，證實(shí)了CM1的H-聚集行為，解釋了CM1 NPs表現(xiàn)出顯著的ACQ效應(yīng)的原因。
 

Figure 4

 

作者繼續(xù)考察了CM1 NPs和CM2 NPs的NIR-Ⅱ血管造影性能。將CM1 NPs或CM2 NPs（100 μl， 1 mg/ml）靜脈注射到小鼠體內(nèi)進(jìn)行后肢血管造影。作者采用1150 LP濾光片截止小于1150 nm的發(fā)射，從而盡可能長(zhǎng)時(shí)間地探索它們?cè)贜IR-Ⅱ的成像能力。如Figure 5a所示，CM2 NPs的高熒光強(qiáng)度使得在使用1150 LP的濾光片情況下，仍可以區(qū)分明亮精確的血管。而靜脈注射CM1 NPs后則沒有觀察到明顯的血管。在Figure 5a中標(biāo)記橫截面線1和2，通過高斯擬合曲線，可得截面線（1）處的血管半峰全寬（FWHM）分別為0.40、0.38和0.37（Figure 5b），而截面線（2）處的血管FWEM分別為0.47、0.50和0.28（Figure 5c）。由此可見，CM2 NPs的高分辨率成像足以成功區(qū)分鄰近的動(dòng)脈和靜脈，表明了其更好的NIR-Ⅱ血管造影性能。此外，CM1 NPs和CM2 NPs均通過肝膽系統(tǒng)代謝出體外。

 

隨后作者研究了商業(yè)染料ICG及IR 1061的血管成像能力，以進(jìn)行對(duì)比。由于808 nm激光的穿透深度及ICG在NIR-Ⅱ窗口的低亮度，靜脈注射ICG后無法清楚區(qū)分后肢脈管系統(tǒng)（Figure 5d）。與之類似，由于嚴(yán)重的熒光淬滅效應(yīng)，IR 1061在980 nm或1064 nm激發(fā)下靜脈注射后幾乎無熒光信號(hào)被收集到。
 

Figure 5

 

作者最后探索了CM2 NPs超過1300 nm的NIR-Ⅱ血管造影性能。由于CM2 NPs在800 – 1400 nm的范圍內(nèi)顯示出寬吸收波長(zhǎng)，作者首先在808、980和1064 nm處分別探索了CM2 NPs在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的血管成像能力。如Figure 6a所示，采用1150 LP濾波器，CM2 NPs在1064 nm波長(zhǎng)激發(fā)下的血管圖像比在808和980 nm波長(zhǎng)激發(fā)下更亮。且在1064 nm波長(zhǎng)的高亮度下，可用0.39和0.41 mm的FWEM區(qū)分鄰近的動(dòng)脈與靜脈（Figure 6b）。但無法在808和980 nm波長(zhǎng)激發(fā)下的血管圖像識(shí)別鄰近的動(dòng)脈與靜脈（Figure 6b）。

 

作者進(jìn)一步將CM2 NPs應(yīng)用于1064 nm激發(fā)下超過1300 nm的血管造影。如Figure 6c所示，采用1300 LP的濾光片的血管成像具有比1150 LP濾光片更低的背景信號(hào)。橫截面線（6）處血管的FWEM分別為0.63和0.52 mm，信號(hào)背景比（SBR）為1.27，橫截面線（7）處血管的FWEM分別為0.58和0.48 mm，SBR為1.33（Figure 6d）。更出色的是，橫截面線（8）處的血管FWEM分別為0.33和0.23 mm，SBR為1.14（Figure 6d），表明1300 LP濾光片的血管成像可以實(shí)現(xiàn)毛細(xì)血管的區(qū)分。由此可知，CM2 NPs能以高分辨率實(shí)現(xiàn)對(duì)超過1300 nm的血管成像。

 

得益于1300 nm的高分辨成像，可通過使用超過1300 nm的成像平臺(tái)區(qū)分不同類型的血管。CM2 NPs的熒光光譜中超過1300 nm的更多發(fā)射部分可有效應(yīng)用于血管成像。而CM1 NPs只有很小的尾峰發(fā)射部分可以達(dá)到1300 nm，這對(duì)于1300 nm以上的高效成像是不夠的。作者隨即考察了CM2 NPs在小鼠體內(nèi)的毒性，以健康小鼠為對(duì)照。血常規(guī)指標(biāo)、血清生化指標(biāo)以及主要器官的H&E染色圖像的結(jié)果顯示，CM2 NPs可用作安全的熒光體內(nèi)顯像劑。
 

Figure 6

 

總結(jié)：作者合成了兩種帶有不同側(cè)鏈的氧雜蒽染料（CM1和CM2），它們表現(xiàn)出NIR-Ⅱ激發(fā)特征、相似的光物理性質(zhì)和良好的穩(wěn)定性。通過將染料包封在F127中制備相應(yīng)的納米粒子，CM2 NPs顯著克服了ACQ效應(yīng)而CM1 NPs沒有，且CM2 NPs表現(xiàn)出高亮度的高效NIR-Ⅱ發(fā)射。作者提出減少CM2的ACQ效應(yīng)的機(jī)制為多重相互作用即分子間氫鍵、π-π相互作用和CH-π相互作用。CM2 NPs的NIR-Ⅱ血管造影顯示出高亮度與對(duì)比度。與NIR-Ⅰ在808 或980 nm激發(fā)下相比，CM2 NPs在1064 nm的NIR-Ⅱ激發(fā)下的圖像具有更高的分辨率，可以區(qū)分鄰近的動(dòng)脈和靜脈。此外，CM2 NPs能夠以低背景信號(hào)實(shí)現(xiàn)超過1300 nm的血管造影，甚至可以分辨小至0.23 mm的毛細(xì)血管。CM2 NPs同時(shí)滿足體內(nèi)熒光團(tuán)的必需條件，對(duì)小鼠具有良好的生物安全性。這種由側(cè)鏈工程驅(qū)動(dòng)的具有降低ACQ效應(yīng)的新型NIR-Ⅱ氧雜蒽染料極大地拓展了未來NIR-Ⅱ高分辨率生物成像的臨床應(yīng)用。

 

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1016/j.bios.2022.114701

 

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