鐵死亡是一種鐵依賴性的，區(qū)別于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬的細(xì)胞程序性死亡 (programmed cell death，PCD) 方式，依賴于鐵介導(dǎo)的氧化損傷，鐵積累的增加，自由基的產(chǎn)生，脂肪酸供應(yīng)與脂質(zhì)過(guò)氧化物增加是誘導(dǎo)鐵死亡的關(guān)鍵。
   
關(guān)于鐵死亡的調(diào)控，主要受 GSH/GPX4 途徑的調(diào)節(jié)；鐵代謝以及脂質(zhì)代謝的相關(guān)通路也發(fā)揮著重要作用。

 

• 關(guān)于 GSH/GPX4 途徑

圖 1. GPX4 相關(guān)信號(hào)通路[1]

System Xc- 是一種廣泛分布在磷脂雙分子層中的重要的抗氧化體系，由兩個(gè)亞基 SLC7A11 和 SLC3A2 組成的異二聚體。胱氨酸和谷氨酸通過(guò) Xc-系統(tǒng) 以 1:1 的比例進(jìn)出細(xì)胞交換，被吸收的胱氨酸 (Cystine) 在細(xì)胞中被還原為半胱氨酸 (Cysteine)，并參與 GSH 的合成。

GPX4 是催化哺乳動(dòng)物細(xì)胞中磷脂氫過(guò)氧化物 (PLOOH) 還原的主要酶。GPX4 將谷胱甘肽 (GSH) 轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽 (GSSG)，并將細(xì)胞毒性脂質(zhì)過(guò)氧化物 (PL-OOH) 還原為相應(yīng)的醇 (PL-OH)。因此，GPX4 活性的抑制可導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累。GPX4 表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞對(duì)鐵死亡更敏感，而 GPX4 表達(dá)上調(diào)則抑制鐵死亡。GSH 在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GPX) 的作用下減少 ROS 和活性氮。

此外，甲羥戊酸 (MVA) 途徑通過(guò)調(diào)節(jié)硒代半胱氨酸 tRNA 的成熟來(lái)影響 GPX4 的合成，從而調(diào)節(jié)鐵死亡的發(fā)生。

小貼士：Erastin 作為最經(jīng)典的鐵死亡誘導(dǎo)劑，可抑制胱氨酸輸入，影響 GSH 的合成，導(dǎo)致 GPX 活性降低，細(xì)胞抗氧化能力下降，脂質(zhì) ROS 積累，最終發(fā)生氧化損傷和鐵死亡。

 

常用的鐵死亡誘導(dǎo)劑 RSL3 直接作用于 GPX4 并抑制其活性，從而降低細(xì)胞的抗氧化能力并積累 ROS，導(dǎo)致鐵死亡。

 

• 脂質(zhì)過(guò)氧化與鐵的積累

圖 2. 脂代謝與鐵死亡相關(guān)通路[2]

 

鐵依賴性脂質(zhì) ROS 積累與所有途徑的鐵死亡有關(guān)。不受限制的脂質(zhì)過(guò)氧化是鐵死亡的標(biāo)志。
 

游離多不飽和脂肪酸是合成脂質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)的底物，但它們必須被酯化成膜磷脂并被氧化才能傳遞鐵死亡信號(hào)。脂氧合酶 (LOX) 和細(xì)胞色素 P450 氧化還原酶 (POR) 通過(guò)脂質(zhì)的雙氧合啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化。研究表明，磷脂酰乙醇胺是誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵磷脂。�；�輔酶 A 合成酶長(zhǎng)鏈家族成員 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰膽堿�；�轉(zhuǎn)移酶 3 (LPCAT3) 參與磷脂酰乙醇胺的生物合成和重構(gòu)，激活多不飽和脂肪酸并影響其跨膜特性。因此，降低 ACSL4 和 LPCAT3 的表達(dá)可減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物底物的積累，從而抑制鐵死亡。

 

鐵積累 (如增加鐵吸收、減少鐵儲(chǔ)存和限制鐵外流)可以促進(jìn)鐵死亡 (具體可見(jiàn): 鐵死亡是什么，如何檢測(cè)？您要的“一文通”來(lái)了！)。過(guò)量的鐵通過(guò)至少兩種機(jī)制促進(jìn)隨后的脂質(zhì)過(guò)氧化：通過(guò)鐵依賴性 Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生活性氧 (ROS) 以及激活含鐵酶。

 

 

• 鐵死亡的關(guān)鍵指標(biāo)

鐵死亡是由鐵依賴的脂質(zhì)過(guò)氧化驅(qū)動(dòng)的，因此在鐵死亡期間檢測(cè)這種脂質(zhì)過(guò)氧化是必要的。此外，線粒體在鐵死亡期間通常表現(xiàn)出萎縮、致密的形態(tài)（因此可以通過(guò)檢測(cè)線粒體來(lái)判斷鐵死亡)。此外，檢測(cè)特定的基因表達(dá)變化：例如鐵死亡的細(xì)胞中 TfR1 的上調(diào)及其重定位于質(zhì)膜。下面小 M 來(lái)給大家介紹幾種常用的鐵死亡檢測(cè)方式~

 

• 最常見(jiàn)的細(xì)胞表型檢測(cè)

鐵死亡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此一般在鐵死亡的研究中，檢測(cè)細(xì)胞活力是常見(jiàn)方法，同時(shí)也會(huì)通過(guò)染色等方法來(lái)觀察細(xì)胞膜通透性，線粒體形態(tài)等。
 
如在 Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis 一文中，作者研究抑制 Frataxin (FXN) 是否會(huì)促進(jìn)鐵死亡。用 Erastin 同時(shí)處理 FXN 敲低和對(duì)照細(xì)胞，12 小時(shí)后用 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果表明抑制 FXN 表達(dá)顯著增強(qiáng)了 Erastin 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。同時(shí)碘化丙啶 (PI) 和 CFDA-SE 染色結(jié)果以及用透射電鏡觀察到的線粒體碎裂、空泡化和嵴增大都表明 FXN 耗竭協(xié)同 Erastin 誘導(dǎo)鐵死亡^[3]。

圖 3. 抑制 FXN 對(duì) Erastin 誘導(dǎo)的 HT-1080 細(xì)胞鐵死亡的影響^[3] 

A, 細(xì)胞暴露于不同濃度的 Erastin，檢測(cè)細(xì)胞活力；B, Erastin 處理細(xì)胞 12 小時(shí)后用熒光顯微鏡觀察 PI 陽(yáng)性細(xì)胞；C, Erastin 培養(yǎng)細(xì)胞 3 天，用 CFDA-SE (5 μM) 染色，然后進(jìn)行流式檢測(cè)；D, 透射電子顯微鏡 (TEM) 檢測(cè)線粒體的形態(tài)變化

 

• 亞鐵離子的檢測(cè)

細(xì)胞鐵積累是鐵死亡的典型標(biāo)志之一，亞鐵離子積累可以特異性地增加氧化應(yīng)激水平。例如，在研究氧化應(yīng)激介導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮 (RPE) 變性的潛在機(jī)制時(shí)，通過(guò)用 FerroOrange 染色細(xì)胞 (亞鐵離子探針)，結(jié)果表明 NaIO₃ 和 Erastin 處理的細(xì)胞積累了過(guò)多的亞鐵離子，說(shuō)明誘導(dǎo)了鐵死亡，而 Fer-1 或 DFO 預(yù)孵育可以抑制亞鐵離子的積累，如圖 4 所示。結(jié)果表明鐵死亡是氧化應(yīng)激介導(dǎo)的 RPE 變性的主要病理過(guò)程^[5]。

 

圖 4. 通過(guò) FerroOrange 染色評(píng)估亞鐵離子水平^[4] 

 

• 活性氧 (ROS) 檢測(cè)

ROS 和脂質(zhì) ROS 在鐵死亡中起關(guān)鍵作用，文獻(xiàn)報(bào)道增加的超氧化物歧化酶 (SOD) 可抑制體內(nèi)的 ROS 水平。細(xì)胞內(nèi)會(huì)由于鐵的積累而抑制抗氧化系統(tǒng)，鐵可能直接通過(guò) Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)量的 ROS，從而增加氧化損傷。因此 ROS 檢測(cè)也是常用方法 (活性氧檢測(cè)探針: ROS 探針大賽，你要的檢測(cè)方法都在這里！)

 

Lin Li 在研究中發(fā)現(xiàn)羧基修飾的聚苯乙烯納米粒子 (CPS) 可以增加細(xì)胞內(nèi) SOD 水平，因此推測(cè) CPS 可能抑制鐵死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CPS 抑制了 RAW 264.7 中 Erastin 誘導(dǎo)的 ROS 升高 (圖 5a, b)，并且比去鐵胺具有更強(qiáng)的抗鐵死亡作用 (圖 5c, d)^[5]。

 

 

 

• 脂質(zhì)過(guò)氧化

除了 ROS 檢測(cè)，鐵死亡的脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)還有谷胱甘肽 (GSH) 合成的變化、脂質(zhì)過(guò)氧化物 (MDA, LPO) 水平的變化。
在遺傳性血色素沉著癥 (HH，一種鐵超負(fù)荷疾病) 與鐵死亡的關(guān)系研究中，為了證實(shí)鐵死亡在 HH 相關(guān)肝損傷中的作用，作者用鐵死亡抑制劑 Fer-1 治療 Hjv^–/– 小鼠 (經(jīng)典的 HH 小鼠模型) 和 Smad4 Alb/Alb 小鼠 (HH 樣小鼠模型) 三周。如圖 6 所示，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng) Fer-1 處理的小鼠肝臟 MDA 水平顯著降低，NADPH 水平增加。此外，F(xiàn)er-1 可以降低小鼠血清 ALT 水平膠原蛋白沉積。結(jié)果表明，鐵超載會(huì)誘導(dǎo) HH 小鼠的鐵死亡^[6]。
 

 圖 6. 鐵死亡抑制劑 Fer-1 可減輕 HH 小鼠中鐵過(guò)載引起的肝損傷^[6]

用或不用 Fer-1 治療的野生型、Hjv^–/–、Smad4^Flox/flox 和 Smad4^Alb/Alb 小鼠中, A, 肝臟 MDA 含量；B, 肝臟 Ptgs2 mRNA 水平；C, 肝臟 NADPH 含量；D, 血清 ALT 水平

 

• 谷胱甘肽代謝

在 DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase 一文中，作者探究了 DJ-1 負(fù)調(diào)節(jié)鐵死亡的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，用 RNA 干擾抑制 DJ-1 表達(dá)可以與 Erastin 協(xié)同抑制細(xì)胞內(nèi) GSH 水平 (圖 7A)。同時(shí)，添加外源性 GSH 或 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 可以逆轉(zhuǎn) Erastin 誘導(dǎo)的脂質(zhì) ROS 積累 (圖 7B) 和細(xì)胞死亡 (圖 7C)。因此，作者推測(cè) DJ-1 可能會(huì)影響 GSH 的合成從而抑制鐵死亡^[7]。

圖 7. DJ-1 通過(guò)抑制 GSH 水平負(fù)調(diào)節(jié)鐵死亡^[7]

A, Erastin 處理DJ-1 KD H1299 細(xì)胞 6 h 后 GSH 水平；

B, 在有無(wú) GSH 或 NAC 條件下細(xì)胞用 Erastin 處理細(xì)胞 12 h 后脂質(zhì) ROS 水平；C, 用Erastin 處理細(xì)胞 36 h 后，測(cè)定細(xì)胞活力

 

總結(jié)：

鐵死亡受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的嚴(yán)密調(diào)節(jié)，既包括鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)通路,更有鐵代謝以及脂質(zhì)代謝相關(guān)通路等。

但是各個(gè)通路相輔相成，互相影響。調(diào)控途徑不同， 檢測(cè)的指標(biāo)也十分多樣化，小伙伴們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中，檢測(cè)方法可要多打 “組合拳”！

 

相關(guān)產(chǎn)品

Erastin 鐵死亡誘導(dǎo)劑，結(jié)合且抑制電壓依賴性陰離子通道 (VDAC2/VDAC3)。

RSL3 鐵死亡誘導(dǎo)劑，可直接降低 GPX4 的表達(dá)。

L-Cystine 一種氨基酸，在細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程中起著重要作用，胱氨酸耗竭會(huì)誘導(dǎo)鐵死亡。

Ferrostatin-1 選擇性的鐵死亡抑制劑，人工合成的抗氧化劑，通過(guò)還原機(jī)制來(lái)防止膜脂的損傷，從而抑制細(xì)胞死亡。

CCK8 試劑盒  細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性檢測(cè)的快速、高靈敏度試劑盒。

Thiazolyl Blue (‍‍MTT)‍‍ 可用于細(xì)胞增殖，活性毒性的檢測(cè)。

H2DCFDA 可滲透細(xì)胞的，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧 (ROS) 水平的探針。

JC-1 試劑盒 用于測(cè)量線粒體膜電位的熒光探針試劑盒。

TMRM Perchlorate 親脂性紅色熒光染料，可用于線粒體膜電位檢測(cè)。

鐵死亡化合物庫(kù) 收集了 500+ 種文獻(xiàn)報(bào)道的具有誘導(dǎo)或抑制鐵死亡相關(guān)的化合物及與鐵死亡密切相關(guān)的靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的化合物，可以用于鐵死亡機(jī)制及相關(guān)疾病的研究。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)

 

 

參考文獻(xiàn)

 

1. Jiang X, et, al. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021 Apr;22(4):266-282.

2. Chen X, Kroemer G, Tang D, et, al. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021 May;18(5):280-296.  

3. Du J, Zhou Y, Li Y, Tong X, Wang Y, et, al. Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis. Redox Biol. 2020 May;32:101483.

4. Tang Z, Ju Y, Dai X, Zhang J, Gu P ,et, al. HO-1-mediated ferroptosis as a target for protection against retinal pigment epithelium degeneration. Redox Biol. 2021 Jul;43:101971.  

5. Wang H, et, al. Characterization of ferroptosis in murine models of hemochromatosis. Hepatology. 2017 Aug;66(2):449-465. 

6. Li L, et, al. Polystyrene Nanoparticles Reduced ROS and Inhibited Ferroptosis by Triggering Lysosome Stress and TFEB Nucleus Translocation in a Size-Dependent Manner. Nano Lett. 2019 Nov 13;19(11):7781-7792.

7. Cao J, et, al. DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase. Nat Commun. 2020 Mar 6;11(1):1251.