造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell, HSC）是血液系統(tǒng)的干細(xì)胞，能夠向下游分化為所有血液細(xì)胞并保持自我更新的能力^[1]。維護(hù)造血干細(xì)胞正常功能對(duì)于維持血液和免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。因此，更好地解析造血干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

隨著高通量測(cè)序以及RNA m6A轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（MeRIP-Seq和miCLIP）的開(kāi)發(fā)利用，RNA m6A參與調(diào)控的生物進(jìn)程也逐漸成為研究熱點(diǎn)。在血液系統(tǒng)中，雖然有一些研究發(fā)現(xiàn)RNA m6A通過(guò)其甲基轉(zhuǎn)移酶Mettl3和Mettl14調(diào)控HSC的功能^[2,3]，但是其分子機(jī)制仍不是很清楚。
 

 

2022年2月，清華大學(xué)藥學(xué)院王建偉團(tuán)隊(duì)在血液專業(yè)期刊《Haematologica》發(fā)表題為“THDF3 modulates hematopoietic stem cells by recognizing RNA m6A modification on Ccnd1”的研究論文。王建偉實(shí)驗(yàn)室2017級(jí)博士生張瀟飛和2019級(jí)博士生叢婷婷為該論文的共同第一作者，王建偉研究員，浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院的姜虹博士和北京解放軍總醫(yī)院朱平主任為共同通訊作者。該研究報(bào)道了METTL3-RNA m6A-YTHDF3-CCND1信號(hào)通路調(diào)控造血干細(xì)胞重建功能的分子機(jī)制。

研究材料
本研究主要使用了Mettl3^fl/fl小鼠、Ythdf1^-/-小鼠、Ythdf3^-/-小鼠（以上三種小鼠均由賽業(yè)生物提供）、Mx1-Cre小鼠、Vav-iCre小鼠、Rosa26-LSL-Cas9敲入小鼠、CD45.1小鼠以及CD45.1/2小鼠。

技術(shù)方法
研究人員使用了流式分析、流式分選、造血干細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)移植、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、短期歸巢實(shí)驗(yàn)、RNA-seq、免疫共沉淀、蛋白質(zhì)合成測(cè)定、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡以及RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

技術(shù)路線
01構(gòu)建Mettl3^{fl/fl、}Ythdf1^-/-、Ythdf3^-/-小鼠模型

02Mettl3^fl/fl、Ythdf1^-/-、Ythdf3^-/-小鼠血液系統(tǒng)表型分析

03RNA m6A通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶Mettl3調(diào)控HSC的功能機(jī)制分析

04RNA m6A通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶Mettl3調(diào)控HSC的模型建立

研究結(jié)果
1.敲除Ythdf3導(dǎo)致HSC的重建能力顯著降低，而敲除Ythdf1不影響HSC的重建能力

首先，研究者構(gòu)建了RNA m6A識(shí)別蛋白YTHDF1和YTHDF3敲除小鼠（圖1A-B）（兩種敲除小鼠均由賽業(yè)生物提供），分選HSC并進(jìn)行造血干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)（圖1C）。結(jié)果顯示，敲除Ythdf1不影響造血干細(xì)胞的重建能力（圖1D），而敲除Ythdf3導(dǎo)致造血干細(xì)胞的重建能力顯著降低（圖1E）。因此，本論文進(jìn)一步探究敲除Ythdf3導(dǎo)致造血干細(xì)胞的重建能力降低的分子機(jī)制。
 

圖1 敲除Ythdf3導(dǎo)致HSC的重建能力降低

2.敲除Ythdf3導(dǎo)致CCND1蛋白表達(dá)降低，但不影響其mRNA的表達(dá)
本研究首先對(duì)Ythdf3^-/- HSCs進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并進(jìn)行信號(hào)通路和基因表達(dá)分析（圖2A）。結(jié)果顯示，敲除Ythdf3導(dǎo)致核糖體信號(hào)通路顯著下調(diào)并且核糖體信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)（圖2B-C）。核糖體是蛋白合成的場(chǎng)所，本研究進(jìn)一步對(duì)造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞（LSKs）蛋白合成情況進(jìn)行檢測(cè)（圖2D）。結(jié)果顯示，敲除Ythdf3導(dǎo)致LSKs蛋白合成顯著下降（圖2E-F）。綜合文獻(xiàn)分析，本研究利用Western Blot實(shí)驗(yàn)對(duì)調(diào)控造血干細(xì)胞功能相關(guān)基因進(jìn)行蛋白表達(dá)檢查，結(jié)果顯示，敲除Ythdf3導(dǎo)致CCND1蛋白表達(dá)下降，但不影響其mRNA的表達(dá)水平（圖2G-H）。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，研究者利用shRNA敲降Ythdf3，檢測(cè)CCND1的蛋白水平和mRNA水平表達(dá)情況。結(jié)果顯示，敲降Ythdf3導(dǎo)致CCND1蛋白水平表達(dá)下降，但不影響其mRNA的表達(dá)水平（圖2I-K）。在敲除Ythdf1的小鼠LSK細(xì)胞中，CCND1的蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異（圖2L）。這說(shuō)明敲除Ythdf3導(dǎo)致CCND1蛋白表達(dá)降低不依賴于YTHDF1的表達(dá)。
 

圖2 敲除Ythdf3導(dǎo)致CCND1蛋白表達(dá)降低

3.YTHDF3通過(guò)靶作用于Ccnd1 mRNA m6A修飾位點(diǎn)并且招募翻譯相關(guān)蛋白PABPC1和eIF4G2促進(jìn)其翻譯
為探究YTHDF3調(diào)控CCND1蛋白表達(dá)的分子機(jī)制，本研究利用生物信息學(xué)對(duì)Ccnd1的mRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其5’UTR潛在RNA m6A修飾位點(diǎn)。因此，本研究構(gòu)建了Ccnd1 mRNA報(bào)告基因載體（WT），以及其突變型報(bào)告基因載體（MUT）。然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)YTHDF3促進(jìn)報(bào)告基因活性顯著升高，并且RNA m6A修飾位點(diǎn)突變后報(bào)告基因活性顯著降低（圖3A-C）。此外，本研究利用RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)YTHDF3與Ccnd1 mRNA直接結(jié)合（圖3D）。以上結(jié)果揭示YTHDF3調(diào)控CCND1蛋白表達(dá)依賴于RNA m6A修飾。同時(shí)發(fā)現(xiàn)分別敲降PABPC1和eIF4G2均導(dǎo)致CCND1蛋白表達(dá)降低（圖3E-F）。Co-IP實(shí)驗(yàn)表明YTHDF3與PABPC1和eIF4G2互作（圖3G-H）。綜合以上結(jié)果，本研究揭示YTHDF3通過(guò)靶作用于Ccnd1 mRNA m6A修飾位點(diǎn)并且招募翻譯相關(guān)蛋白PABPC1和eIF4G2促進(jìn)其翻譯。那么CCND1是否調(diào)控造血干細(xì)胞的重建能力？
 

 

圖4 過(guò)表達(dá)CCND1完全挽救由于缺失Ythdf3導(dǎo)致重建能力降低的表型

5.METTL3通過(guò)促進(jìn)Ccnd1 RNA m6A修飾調(diào)控CCND1的翻譯
為進(jìn)一步探究Ccnd1 mRNA上m6A修飾位點(diǎn)是否由RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3寫(xiě)入的，本研究進(jìn)行甲基化RNA免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示敲降METTL3顯著降低m6A抗體對(duì)Ccnd1 mRNA的富集能力（圖5A-B）。其結(jié)果揭示METTL3的表達(dá)促進(jìn)Ccnd1 mRNA m6A修飾的發(fā)生。同時(shí)，本研究在小鼠LSK中發(fā)現(xiàn)，敲除Mettl3導(dǎo)致CCND1蛋白表達(dá)降低，但不影響其mRNA水平的表達(dá)（圖5C-D）。同時(shí)，研究者利用報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Rip-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)METTL3通過(guò)依賴于RNA m6A的方式調(diào)控CCND1的表達(dá)（圖5E-G）。
 

圖5 METTL3通過(guò)促進(jìn)Ccnd1 RNA m6A修飾調(diào)控CCND1的翻譯

6.缺失Mettl3導(dǎo)致HSC重建能力顯著降低，并且過(guò)表達(dá)CCND1部分挽救由于缺失Mettl3導(dǎo)致HSC重建能力降低的表型
為進(jìn)一步探究缺失Mettl3對(duì)造血干細(xì)胞重建能力的影響。本研究分別進(jìn)行Mettl3敲除（由賽業(yè)生物提供）和敲降造血干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)（圖6A和6C-D）。結(jié)果顯示，敲除和敲降Mettl3均導(dǎo)致造血干細(xì)胞的重建能力顯著降低（圖6B和6E）。但是，敲除Mettl3導(dǎo)致造血干細(xì)胞完全不能重建血液系統(tǒng)（圖6B），而敲降Mettl3的造血干細(xì)胞重建能力顯著降低，但仍具有一定重建血液系統(tǒng)的能力（圖6E），原因可能是敲降Mettl3后，造血干細(xì)胞中還保留一定Mettl3蛋白表達(dá)。此結(jié)果揭示METTL3是維持造血干細(xì)胞干性的必須基因。那么過(guò)表達(dá)CCND1是否可以挽救由于缺失Mettl3導(dǎo)致造血干細(xì)胞重建能力降低的表型？在敲除Mettl3的造血干細(xì)胞中，由于造血干細(xì)胞干性的丟失，過(guò)表達(dá)CCND1并不能挽救由于敲除Mettl3導(dǎo)致造血干細(xì)胞重建能力降低的表型。在敲降Mettl3的造血干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CCND1，可以部分挽救由于敲降Mettl3導(dǎo)致造血干細(xì)胞重建能力降低的表型（圖6F-G）。
 

圖6 缺失Mettl3導(dǎo)致HSC重建能力顯著降低，過(guò)表達(dá)CCND1部分挽救由于缺失Mettl3導(dǎo)致HSC重建能力降低的表型

研究結(jié)論
綜上所述，本研究首次闡明了造血干細(xì)胞重建功能的信號(hào)通路之一為：METTL3→RNA m6A→YTHDF3→CCND1（圖7），為探索RNA m6A等RNA修飾調(diào)控造血干細(xì)胞等體細(xì)胞干細(xì)胞的功能機(jī)制提供了重要參考。該研究有助于研究者更加深入了解造血干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，同時(shí)也為改善造血干細(xì)胞的功能提供一種新的途徑。
 

圖7 METTL3→RNA m6A→YTHDF3→CCND1信號(hào)通路調(diào)控HSC重建功能模式圖
 

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建

賽業(yè)生物『紅鼠資源庫(kù)』可提供同類型Mettl3、Ythdf3、Ythdf1基因敲除小鼠，快至兩周發(fā)貨，助力科學(xué)研究。
 

Mettl3基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6N-Mettl3^em1(flox)Cya

品系編號(hào)：
CKOCMP-56335-Mettl3-B6N-VA

產(chǎn)品編號(hào)：
S-CKO-12035

應(yīng)用方向：
❖ 發(fā)育生物學(xué)
❖ 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；蛋白質(zhì)代謝
❖ 細(xì)胞分化；胚胎

Ythdf3基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6N-Ythdf3^em1Cya

品系編號(hào)：
KOCMP-229096-Ythdf3-B6N-VA

產(chǎn)品編號(hào)：
S-KO-06231

應(yīng)用方向：
❖ 皮膚；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
❖ RNA剪接；蛋白質(zhì)代謝
❖ 色素/膚色

Ythdf1基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6N-Ythdf1^em1Cya

品系編號(hào)：
KOCMP-228994-Ythdf1-B6N-VA

產(chǎn)品編號(hào)：
S-KO-06224

應(yīng)用方向：
❖ 發(fā)育生物學(xué)
❖ 心血管系統(tǒng)；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
❖ 蛋白質(zhì)代謝