致病機(jī)理
★經(jīng)典型苯丙酮尿癥（PKU）
正常情況下，苯丙氨酸是通過肝細(xì)胞產(chǎn)生的苯丙氨酸羥化酶（PAH）轉(zhuǎn)化為酪氨酸，之后再分別合成甲狀腺素，腎上腺素和黑色素等途徑來完成代謝（如圖1）。
 

圖1 正常人體內(nèi)苯丙氨酸代謝途徑^[1]

而PKU患者由于缺乏苯丙氨酸羥化酶，使得苯丙氨酸不能羥化為酪氨酸，所以遵循另一條代謝通路，即苯丙氨酸（Phe）與α-酮戊二酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨基作用，生成苯丙酮酸，引發(fā)大量的苯丙酮酸在血液和組織中堆積，最后于尿液中排出。而苯丙酮酸的代謝產(chǎn)物在中樞神經(jīng)積累并產(chǎn)生毒性，會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（如圖2）。

★四氫生物蝶呤（BH4）缺乏癥
三磷酸鳥苷（GTP）在三種合成酶作用下，合成無活性的四氫生物蝶呤，后者與氧氣結(jié)合生成4α-羥化四氫生物蝶呤，然后在翼素-4α-卡賓明脫水酶（PCD）作用后生成（二氫生物蝶呤）BH2，再在二氫生物喋呤還原酶（DHPR）作用下，生成具有生物活性的BH4，發(fā)揮重要的生理作用（如圖3）。
 

圖3 四氫生物喋呤生成過程^[1]

生成的BH4會(huì)與Phe通過一種GTPCH刺激蛋白（P35）起著調(diào)節(jié)GTPCH的作用，當(dāng)血Phe增高時(shí)，通過增強(qiáng)GTPCH作用促進(jìn)新喋呤和生物喋呤的合成（如圖4）^[1]。
 

圖4 四氫生物喋呤作用過程^[1]

小鼠模型
目前應(yīng)用廣泛的苯丙酮尿癥疾病小鼠模型為Pah^enu1和Pah^enu2兩種，這兩種模型小鼠都是用化學(xué)誘變劑乙�；鶃喯趸�脲（ENU）誘變獲得。但Pah^enu2小鼠肝臟所表達(dá)的突變蛋白基本上檢測(cè)不到催化活性，此外Pah^enu2小鼠在7號(hào)外顯子上發(fā)生點(diǎn)突變，攜帶這一突變型的患者比Pah^enu1小鼠突變型攜帶者更多。因此對(duì)于苯丙酮尿癥的研究使用的多是Pah^enu2模型小鼠。

還有學(xué)者利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建丙酮癥疾病小鼠模型Pah^R408W。根據(jù)野生型小鼠Pah基因的12號(hào)外顯子序列設(shè)計(jì)靶點(diǎn)并設(shè)計(jì)同源重組模板，同源重組模板上帶有胞嘧啶突變成胸腺嘧啶的點(diǎn)突變，從而在DNA修復(fù)過程中在小鼠胚胎DNA上引入胞嘧啶到胸腺嘧啶的點(diǎn)突變，最終將PAH蛋白氨基酸序列408位的精氨酸突變成色氨酸（圖5）。
 

圖5 Pah^R408W模型設(shè)計(jì)示意圖

藍(lán)色堿基為靶點(diǎn)sgRNA序列，紅色堿基為突變前的堿基，綠色堿基標(biāo)注出PAM區(qū)域^[2]

通過顯微注射的方式引入CRISPR/Cas9元件，小鼠出生后檢測(cè)F0代小鼠基因型，最終獲得陽性小鼠25只，其中Pah^R408W小鼠3只。且Pah^R408W小鼠具有典型的苯丙酮尿癥病癥，正常生理狀況下，體內(nèi)的苯丙氨酸在苯丙氨酸羥化酶作用下代謝生成酪氨酸，隨后一部分酪氨酸在相關(guān)酶的作用下生成黑色素。當(dāng)體內(nèi)苯丙氨酸羥化酶活性降低，不能正常代謝苯丙氨酸成酪氨酸，因此不能合成足夠多的黑色素，導(dǎo)致出現(xiàn)毛色色素衰退的癥狀。首先對(duì)成年（8周齡）野生型和Pah^R408W小鼠進(jìn)行毛色對(duì)比。通過與野生型小鼠對(duì)比，發(fā)現(xiàn)成年（8周齡）Pah^R408W小鼠毛色出現(xiàn)明顯的色素減退的癥狀（圖6）^[2]。
 

圖6 小鼠毛發(fā)顏色圖^[2]

治療方法
目前尚無方法可以根治PKU，最常見的方法是在新生兒篩查中做到"早發(fā)現(xiàn)早治療”，減少對(duì)患兒生長(zhǎng)發(fā)育及智力發(fā)育等方面損害。因此快速、有效、精準(zhǔn)的基因診斷對(duì)PKU患兒的盡早治療十分有意義^[3]。當(dāng)前PKU治療方法主要以飲食療法、糖巨肽法、大中性氨基酸法、補(bǔ)充四氫生物蝶呤法為主，其他潛在療法包括酶替代療法和基因療法仍在探究中。

★飲食療法
如果PKU患者不進(jìn)食或少進(jìn)食含苯丙氨酸的食物，則PKU基因未必會(huì)對(duì)患者造成傷害，所以限制苯丙氨酸攝入不失為一個(gè)好方法。由于大部分食物中都含有苯丙氨酸，低苯丙氨酸飲食來源有兩種，一種是天然低蛋白食物，另一種為人工合成的氨基酸藥食。對(duì)于純天然的低蛋白食物仍然要嚴(yán)格控制攝入量，且要補(bǔ)充其他人體必要氨基酸，維生素等，以免造成營(yíng)養(yǎng)失衡和骨質(zhì)疏松、神經(jīng)損傷加劇等并發(fā)癥，而人工合成的氨基酸藥食口味差，進(jìn)食量又大，會(huì)導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，對(duì)飲食療法的遵循度降低^[4]。

★糖巨肽療法（glycomacropeptides, GMP）
GMP是來自源于干酪乳清的天然蛋白質(zhì)，其苯丙氨酸含量低，但富含纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸等人體必需氨基酸，也可作為患者低苯丙氨酸食物的來源，目前已用于PKU的治療。GMP飲食療法可與其他療法聯(lián)合使用，用于治療PKU患者尤其是需嚴(yán)格控制苯丙氨酸攝入的患者。然而該療法具有免疫性不明確且缺乏長(zhǎng)期食用的臨床安全性數(shù)據(jù)等缺點(diǎn)，該方法用于PKU的治療仍需進(jìn)一步觀測(cè)。

★大中性氨基酸法（large neutral amino acids, LNAA）
大中性氨基酸包括支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨基酸）和芳香氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）等，這些大中性氨基酸可與苯丙氨酸競(jìng)爭(zhēng)性與腦部L型氨基酸運(yùn)載體結(jié)合，抑制苯丙氨酸通過胃腸黏膜和血腦屏障，進(jìn)而降低苯丙氨酸在胃腸道的吸收和減少其進(jìn)入腦部的量。故通過飲食增加血液中其他LNAA的濃度，也成為治療PKU的一種方法。但該方法一般推薦成人患者使用。該方法缺乏長(zhǎng)期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，需進(jìn)一步研究來證明其治療結(jié)果的安全性和有效性。

★補(bǔ)充四氫生物蝶呤療法
四氫生物蝶呤作為苯丙氨酸羥化酶的輔助因子，能夠顯著降低BH4缺乏型和對(duì)BH4治療產(chǎn)生反應(yīng)的PAH缺乏型患者體內(nèi)苯丙氨酸濃度。二鹽酸沙丙蝶呤（sapropterin dihydrochloride）是人工合成的BH4，最初是由日本Daiichi Sankyo公司研制，其片劑由BioMarin Internation公司研制，商品名：KUVAN。該化合物于2007年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，用于治療苯丙酮尿癥及高苯丙氨酸血癥。

★苯丙氨酸氨解酶法（phenylalanine ammonialyase, PAL）
研究發(fā)現(xiàn)，通過注入外源性苯丙氨酸氨解酶，可降低患者體內(nèi)苯丙氨酸濃度，從而達(dá)到治療疾病的目的。因?yàn)楸奖�氨酸氨解酶可將苯丙氨酸降解為E-肉桂酸和少量的氨，E-肉桂酸可迅速轉(zhuǎn)化為馬尿酸，隨尿液排出體外，所以此代謝途徑可降低患者體內(nèi)苯丙氨酸濃度。目前，已經(jīng)啟動(dòng)PEG-PAL的Ⅲ期臨床研究，用于評(píng)價(jià)藥物的安全性和有效性^[5]。

★基因療法
近年來隨著生物醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，基因療法取得了很大的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，98%的PKU患者是由于苯丙氨酸羥化酶基因突變導(dǎo)致患者體內(nèi)苯丙氨酸羥化酶缺乏或活性不足。苯丙氨酸羥化酶致病突變基因大多位于外顯子區(qū)域，且主要集中在外顯子3、外顯子6、外顯子7和外顯子11上。通過基因轉(zhuǎn)移方法，將含有鼠源PAH-cDNA注入到PKU模型小鼠體內(nèi)，可恢復(fù)小鼠肝臟中苯丙氨酸羥化酶的活性，使苯丙氨酸的代謝恢復(fù)正常，從而降低小鼠體內(nèi)苯丙氨酸的濃度。另一種研究方法是基于PKU患者體內(nèi)苯丙氨酸羥化酶基因的無義突變。大約10%的PKU患者是由于苯丙氨酸羥化酶基因發(fā)生無義突變，產(chǎn)生不穩(wěn)定或者無活性的截短蛋白。對(duì)攜帶PAH基因無義突變的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株（COS-7和HEK293）給予氨基糖苷類藥物慶大霉素和遺傳霉素（geneticin，G418），該細(xì)胞株在體外可表達(dá)全長(zhǎng)并且有活性的PAH。結(jié)果顯示，無義突變藥物也是一種潛在治療PKU疾病的方法，但仍然需要對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)藥效學(xué)研究^[6]。
 

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參考文獻(xiàn)及引用圖片來源：

[1]朱曉涵.苯丙酮尿癥的致病機(jī)理與防治措施研究[J].當(dāng)代化工研究,2018(09):187-189.

[2]馬列. CRISPR-Cas9技術(shù)在苯丙酮尿癥小鼠模型構(gòu)建及基因治療的應(yīng)用研究[D].華東師范大學(xué),2017.

[3]李錦,李晶,李娜娜,陳寧,孟巖,潘亭亭,張蔓麗,朱軍,田亞平.吉林和遼寧地區(qū)80例苯丙酮尿癥患兒苯丙氨酸羥化酶基因突變分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2021,42(08):843-848+889.

[4]朱曉涵.苯丙酮尿癥的致病機(jī)理與防治措施研究[J].當(dāng)代化工研究,2018(09):187-189.

[5]馬列. CRISPR-Cas9技術(shù)在苯丙酮尿癥小鼠模型構(gòu)建及基因治療的應(yīng)用研究[D].華東師范大學(xué),2017.

[6]牛瑞青,馮文化.苯丙酮尿癥及相關(guān)治療方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志,2018,27(02):154-158.