糖尿病腎病(DKD)發(fā)生在~40%的糖尿病患者中，并會導(dǎo)致腎衰竭和心血管疾病。研究者使用單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序(snRNA-seq)分析了小鼠DKD模型的五種治療方案。百萬級別的細(xì)胞圖譜顯示，所有腎細(xì)胞類型對DKD及其治療均有異質(zhì)反應(yīng)。單一療法和聯(lián)合療法針對不同的細(xì)胞類型，并誘導(dǎo)了明顯的轉(zhuǎn)錄變化。鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑(SGLT2i)在近端小管S1段的早期影響表明，這類藥物可以誘導(dǎo)禁食模擬和缺氧反應(yīng)。糖尿病腎病模型中近端小管中剪接體調(diào)節(jié)蛋白絲氨酸/精氨酸豐富剪接因子7 (Srsf7)下調(diào)，該因子又可被SGLT2i特異性回復(fù)。在體外，近端小管敲除Srsf7誘導(dǎo)了一種促炎癥表型，這意味著可變剪接是DKD的驅(qū)動因素，表明了SGLT2i調(diào)控近端小管的可變剪接是這類藥物的潛在作用機(jī)制。

 

文章題目：Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies

中文題目：關(guān)于小鼠糖尿病腎病治療的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

見刊時(shí)間：2022.07

期刊名稱：Cell Metabolism

影響因子：31.373

實(shí)驗(yàn)平臺：10x Chromium單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序

DOI：10.1016/j.cmet.2022.05.010

 

研究內(nèi)容

• 小鼠腎臟中的細(xì)胞異質(zhì)性

研究者首先構(gòu)建了小鼠的糖尿病腎病模型，并且通過檢測尿白蛋白/肌酐比(UACR)、收縮壓(SBP)和葡萄糖來檢測模型構(gòu)建質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)共分為7組：db/m (control)、db/db (vehicle)、db/db + ACEi、db/db + Rosi、db/db + SGLT2i、db/db + ACEi + Rosi和db/db +ACEi + SGLT2i。糖尿病腎病小鼠進(jìn)行相應(yīng)方式給藥后，研究者對UACR, SBP和葡萄糖再次進(jìn)行檢測評價(jià)出聯(lián)合治療方式比單一治療方式更佳（如圖1）。隨后研究者對小鼠腎臟組織用10xChromium平臺進(jìn)行了單細(xì)胞核測序并得到了一共946,660個(gè)高質(zhì)量的單細(xì)胞，這些單細(xì)胞被分成了18個(gè)細(xì)胞群。研究者觀察到內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、TAL細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間存在顯著的異質(zhì)性。研究者還分別對這四種細(xì)胞的亞型進(jìn)行了鑒定（如圖2）。

圖1實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，組織學(xué)和生理學(xué)數(shù)據(jù)

圖2 DKD小鼠模型藥物治療的單細(xì)胞圖譜

 

• DKD進(jìn)展過程中基因的差異表達(dá)

研究者為了評估DKD進(jìn)展過程中的基因表達(dá)變化，比較了對照組(db/m)、db/db組和db/db + reninAAV組小鼠在2天和2周的snRNA-seq譜。差異表達(dá)基因數(shù)量最多的細(xì)胞類型包括主細(xì)胞(PC)、TAL、頂葉上皮細(xì)胞(PECs)、PT和內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)。超過一半的差異表達(dá)基因僅在單細(xì)胞類型中檢測到，這顯示出糖尿病模型中腎細(xì)胞的異質(zhì)性。隨后研究者分析了在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)異質(zhì)性最強(qiáng)的兩種細(xì)胞群中上調(diào)和下調(diào)的基因。這項(xiàng)分析確定了許多可能作為疾病生物標(biāo)志物的基因。已知DKD中某些特定腎細(xì)胞類型存在差異表達(dá)基因，研究者接下來用GWAS識別出慢性腎臟疾病(CKD)相關(guān)常見變異是否也與特定的腎臟細(xì)胞類型有關(guān)。隨后利用MAGMA將GWAS估算的腎小球?yàn)V過率(eGFR)、蛋白尿和血尿素氮(BUN)與疾病進(jìn)程中每種細(xì)胞類型聯(lián)系起來。分析結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞和收集管細(xì)胞(PC和遠(yuǎn)曲小管[DCT])與eGFR顯著相關(guān)。PC與CKD顯著相關(guān)。而PC和EC也為DKD中差異表達(dá)基因(DEGs)數(shù)量最多的前三種細(xì)胞類型（如圖3）。

圖3 DKD進(jìn)展過程中的基因表達(dá)變化

 

• DKD治療的細(xì)胞異質(zhì)性

接下來，研究者研究了不同的治療方案在多大程度上可以回復(fù)每種細(xì)胞類型中由DKD誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化。研究結(jié)果表明：某些細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄變化發(fā)生在早期，而有些細(xì)胞類型則恰恰相反。因此不同治療方案對細(xì)胞類型和時(shí)間存在特異性影響。例如，與第14天相比，第2天足細(xì)胞、DCT和連接小管(CNT)中的疾病基因被回復(fù)的比例更高，而與第2天相比，14天的治療回復(fù)了更多的TAL和DTL中的疾病基因。然而，在PEC、TAL、PC和ICA中，通過Rosi治療的靶基因和通路是非常不同的，但它們都通過治療得到了改善。隨后研究者對疾病及其治療過程中細(xì)胞間通訊模式及其變化進(jìn)行了分析。分析結(jié)果顯示：細(xì)胞通訊變化最顯著的細(xì)胞類型包括足細(xì)胞、PT、DTL和TAL。研究者研究了每種治療方案如何使足細(xì)胞、PT和TAL的信號評分標(biāo)準(zhǔn)化：SGLT2i的單獨(dú)治療的情況下，PT細(xì)胞的評分最好。本分析特異性鑒定了受損PT信號通路與足細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共同分泌的骨橋蛋白(Spp1)。Spp1已被證明通過調(diào)節(jié)DKD模型中的足細(xì)胞信號通路在蛋白尿中發(fā)揮重要作用。ACEi + Rosi或ACEi + SGLT2i聯(lián)合治療能最好地抑制骨橋蛋白細(xì)胞間信號，這與損傷標(biāo)志物Havcr1的表達(dá)降低相關(guān)，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了聯(lián)合治療效果更佳（如圖4）。

圖4 根據(jù)損傷的細(xì)胞類型和損傷后的細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的通訊，將差異表達(dá)的基因經(jīng)處理歸一化

 

• 聯(lián)合用藥治療PT細(xì)胞的損傷

研究者經(jīng)綜合分析確定了一組用于研究的損傷狀態(tài)的近端小管細(xì)胞(注釋為“inji .PT”)，其表達(dá)典型的標(biāo)志物：Havcr1、Vcam1和C3。聯(lián)合用藥可顯著降低DKD中PT損傷標(biāo)志物Havcr1的異常上調(diào)，并且比單一用藥效果好。對小鼠樣本進(jìn)行Bulk RNA-seq，并證實(shí)聯(lián)合治療在降低損傷PT細(xì)胞比例方面最有效。研究者進(jìn)一步比較了聯(lián)合治療組與單一治療組糖尿病腎損傷PT的基因表達(dá)變化。該分析顯示，單一藥物治療后損傷評分沒有顯著變化，但聯(lián)合治療2周后損傷評分顯著下降。作為補(bǔ)充分析，研究者應(yīng)用了另一種算法(scID)分析后顯示：兩種藥物聯(lián)合治療后，損傷的PT細(xì)胞可以更大比例映射到健康的腎臟細(xì)胞(如圖5)。

圖5 聯(lián)合治療改善近端小管損傷更有效

 

• 藥物治療對腎小球的反應(yīng)

研究者首先確定了腎小球亞細(xì)胞類型：足細(xì)胞（Pod）、系膜細(xì)胞(MCs)、GECs和PEC。隨后對這四種細(xì)胞中的marker基因進(jìn)行了展示。研究者參考前人研究數(shù)據(jù)并依據(jù)相應(yīng)細(xì)胞類型整理了人類和小鼠DKD共同差異基因表達(dá)的列表，從而評估了不同治療方案對DKD相關(guān)基因表達(dá)的影響，并再次揭示了異質(zhì)性。接下來，研究者對介導(dǎo)GEC到足細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的配體受體對進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞來源的Bmp6-（Bmpr1b+Bmpr2）信號通路可被糖尿病強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而這一信號通路在SGLT2i單獨(dú)或聯(lián)合治療時(shí)明顯減弱。與Bmp6-（Bmpr1b+Bmpr2）不同，Bmp6-（Bmpr1a+Bmpr2）在GECs中有糖尿病會特異性上調(diào)，其受體Bmpr1a在足細(xì)胞中高表達(dá)（如圖6）。

圖6 糖尿病腎小球通訊網(wǎng)絡(luò)及其治療

 

• 通過比較SGLT2i對PTS1和PTS2的影響，推斷SGLT2i的機(jī)制

SGLT2i靶向鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Slc5a2，該蛋白專一表達(dá)于PT S1段的頂膜上。研究者對此進(jìn)行了證實(shí)。隨后他們對單一治療和聯(lián)合治療在2周時(shí)如何改變S1和S2片段的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。證明S1段確為SGLT2抑制的直接靶點(diǎn)。接下來，他們對S1和S2的所有EDG進(jìn)行GO分析。結(jié)果表明，SGLT2i直接誘導(dǎo)S1段的饑餓模擬和缺氧反應(yīng)。研究者又對S1和S2數(shù)據(jù)集中EDG進(jìn)行了分析得出結(jié)論：顯著上調(diào)的因子Srsf7可能參與其中。Srsf7可編碼調(diào)節(jié)mRNA剪接的絲氨酸/精氨酸(SR)剪接體蛋白。有研究表明，Srsf7在小鼠中可以通過調(diào)節(jié)促進(jìn)合成代謝和抑制衰老途徑的基因的可變剪接來促進(jìn)幼年轉(zhuǎn)錄組基因程序。因此，SGLT2i的一種作用機(jī)制可能是調(diào)節(jié)可變剪接來激活保護(hù)性的代謝（補(bǔ)充圖，此處未列出）。

研究者證實(shí)，只有SGLT2i可回復(fù)S1段的Srsf7表達(dá)。他們建立體外細(xì)胞培養(yǎng)模型[人原代腎PT細(xì)胞(RPTEC)]發(fā)現(xiàn)：在RPTEC中通過小干擾RNA (siRNA)敲除Srsf7，mRNA和蛋白敲降效率均>80%。對其進(jìn)行Bulk RNA-seq顯示了基因表達(dá)的巨大差異。對這些基因變化的通路分析顯示，Srsf7基因敲除后，多種促炎因子表達(dá)上調(diào)，表明Srsf7基因通常在S1段促進(jìn)健康和抗炎表型。進(jìn)一步分析顯示：許多被SGLT2i回復(fù)的基因在Srsf7敲除后也存在差異表達(dá)，這提示了我們的體外模型和體內(nèi)結(jié)果之間有一定的機(jī)制聯(lián)系（如圖7）。

圖7 SGLT2i對S1段和S2段的影響

 

主要結(jié)論

研究者構(gòu)建了糖尿病腎病小鼠模型并進(jìn)行不同方式給藥處理（共五種），在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)（治療2天和2周）使用單細(xì)胞核測序了百萬級別的細(xì)胞并進(jìn)行了相應(yīng)的分析，分析結(jié)果體現(xiàn)了細(xì)胞之間的異質(zhì)性，并且聯(lián)合治療要比單一治療效果更好。研究者的DKD單細(xì)胞圖譜及其治療方法將有助于詳細(xì)探索疾病進(jìn)展的機(jī)制，并更深入地了解目前的治療方法如何減緩DKD的進(jìn)展。

 

參考文獻(xiàn)：

Wu H, Villalobos RG, Yao X, Reilly D, Chen T, Rankin M, Myshkin E, Breyer MD, Humphreys BD. Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies. Cell Metab. 2022 Jul 5;34(7):1064-1078.e6. doi: 10.1016/j.cmet.2022.05.010. Epub 2022 Jun 15. PMID: 35709763; PMCID: PMC9262852.