C9orf72 基因中的GGGGCC重復(fù)擴(kuò)增是額顳葉癡呆（FTD）和肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）最常見的遺傳原因，而且重復(fù)的非ATG翻譯導(dǎo)致二肽重復(fù)蛋白(DPRs)的產(chǎn)生。隨著靶向重復(fù)擴(kuò)增的潛在療法進(jìn)入臨床試驗(yàn)，迫切需要一種高敏的生物標(biāo)記物對靶點(diǎn)作用進(jìn)行分析。本文研究者利用Simoa技術(shù)開發(fā)了一種靈敏可靠的poly（GP）二肽重復(fù)蛋白測定方法。

文章題目：Development of a sensitive trial-ready poly(GP) CSF biomarker assay for C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis

發(fā)表時(shí)間：2022年4月

期刊名稱：J Neurol Neurosurg Psychiatry

影響因子：13.654

DOI：10.1136/jnnp-2021-328710

研究概述

研究人員通過Simoa平臺開發(fā)了一種免疫分析方法，用于測量C9orf72相關(guān)FTD和ALS患者腦脊液（CSF）中C9orf72重復(fù)擴(kuò)增產(chǎn)生的poly(GP) 二肽重復(fù)蛋白（DPR）。

研究表明，該分析方法高度靈敏和穩(wěn)定，通過了廣泛的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，板內(nèi)、板間的變異性低、標(biāo)曲和樣品的精密度和準(zhǔn)確度高、稀釋線性好、對樣品和標(biāo)準(zhǔn)凍融具有耐受性，以及不受血紅蛋白干擾。使用這種方法來測量FTD突變攜帶者隊(duì)列收集的CSF樣本中的poly(GP) （N=40 C9orf72和15個(gè)對照）。CSF中C9orf72的poly(GP) 信號，樣本組的平均信號值比對照組高38倍，最低的樣本比對照組高8倍，均低于該方法的定量下限。而且檢測的特異性和敏感性均為100%，靶標(biāo)檢測的窗口較大。

這些數(shù)據(jù)表明，基于Simoa的poly（GP）DPR分析適合用于臨床試驗(yàn)，以明確旨在減少C9orf72重復(fù)的治療藥物的靶向治療。

研究內(nèi)容

1、Simoa poly(GP) assay建立

首先使用Simoa HD-1對assay進(jìn)行優(yōu)化。研究人員測試了一系列抗體，包括小鼠抗GP單克隆抗體（mGP），和一系列針對不同長度GP肽的兔多克隆抗體（GP57、GP60和GP6834）。綜合考慮后選擇了小鼠抗GP單克隆抗體（mGP）作為捕獲抗體，多克隆抗體組合（GP57−60）作為檢測抗體，標(biāo)準(zhǔn)品為GST-GP32肽段。這套組合的信噪比最高，為2.51；且LLOQ最低，為1.04pg/ml（圖1）。為了確保長期的兼容性，接下來將分析轉(zhuǎn)移到新的Simoa HD-X平臺。且對該assay進(jìn)行了重新優(yōu)化，將標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液從裂解液稀釋液B（HD-1）更改為稀釋液A（HD-X）效果最好（圖2A）。此外，SBG從100μM降至50μM，LLOQ為1.17 pg/mL（圖2B）。

Fig.1 Simoa homebrew assay中各抗體組合的比較。虛線分別表示每種測定方法優(yōu)化后預(yù)測的LLOQ。AEB：平均每顆磁珠上的酶標(biāo)數(shù)；LLOQ：定量下限；Simoa：單分子陣列；*：代表此種抗體已標(biāo)記上生物素。

Fig.2 將poly(GP) assay轉(zhuǎn)移到Simoa HD-X平臺。（A）在人腦脊液加入25 pg/mL GST-GP32標(biāo)準(zhǔn)品，然后用不同的Quanterix稀釋液1:2進(jìn)行稀釋，通過比較信號/噪聲(S/N)來評估樣品稀釋液的效果。（B）使用Quanterix分析顯像工具計(jì)算擬合的標(biāo)準(zhǔn)品曲線，虛線顯示LLOQ為1.17 pg/mL。

2. Simoa poly(GP) assay驗(yàn)證為將該assay用于臨床試驗(yàn)，使用標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)記物分析鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估（表2）。由圖3可知，各項(xiàng)結(jié)果表明，該測定具有高度的靈敏度和穩(wěn)健性，通過了標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)記物分析鑒定標(biāo)準(zhǔn)的評估，包括板內(nèi)和板間的低變異性、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的高精密度和準(zhǔn)確度、稀釋線性、樣品和標(biāo)準(zhǔn)凍融耐受性以及血紅蛋白干擾測試。

Fig.3 CSF poly(GP) Simoa assay驗(yàn)證結(jié)果。制備了10點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線和3個(gè)質(zhì)量控制(QC)樣品，分別進(jìn)行了7次獨(dú)立檢測。(A) 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的變異系數(shù)(CV)均小于20%。(B)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的總差(DFT)。DFT=標(biāo)準(zhǔn)品的預(yù)測濃度與實(shí)際濃度之差的%。(C)QC樣品的CVs。(D)由兩個(gè)工作人員分別制備的QC樣本的AEB信號值。(E) QC樣品

3.使用優(yōu)化的Simoa測定法測量C9orf72 擴(kuò)增載體CSF中的poly(GP)

使用這種優(yōu)化后的測定方法來測量健康對照組（N=15）和C9orf72擴(kuò)增陽性組（N=40）的腦脊液隊(duì)列中的poly(GP)。來自最低C9orf72樣本的分析信號的信噪比是對照樣本平均信號的八倍，顯示出與對照CSF信號的明顯分離（圖4A）。C9orf72組與對照組的信噪比平均為38倍。健康人腦脊液中的poly(GP)在15個(gè)樣本中有13個(gè)低于檢測限，其余2個(gè)低于LLOQ。

在所有C9orf72組中檢測到poly(GP)高于LLOQ，在沒有健康對照的情況下，敏感性和特異性均為100%。在C9orf72擴(kuò)增陽性樣本中，poly(GP) 的測量范圍為6-148 pg/mL。發(fā)現(xiàn)男性和女性C9orf72擴(kuò)增陽性樣本之間的poly(GP) 水平?jīng)]有差異。發(fā)現(xiàn)CSF poly(GP)水平與癥狀性C9orf72擴(kuò)增陽性樣本（n=15）的發(fā)病年齡之間沒有相關(guān)性（圖4C）。有趣的是，對所有40例C9orf72擴(kuò)增陽性病例進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，樣本采集時(shí)的年齡與腦脊液中測得的poly（GP）之間存在顯著的中度正相關(guān)（r=0.3643）。然而，如果從分析中刪除具有最高poly(GP)水平的情況，則p值變?yōu)閜=0.0522。

Fig.4 C9orf72擴(kuò)增攜帶者腦脊液中Poly(GP) 水平

總結(jié)

1. 準(zhǔn)確測量FTD和ALS引起C9orf72 重復(fù)擴(kuò)增產(chǎn)生的DPR，將是評估臨床試驗(yàn)中重復(fù)/DPR降低策略目標(biāo)參與度的關(guān)鍵工具。
2. 現(xiàn)有免疫測定法，可以檢測患者CSF中的poly(GP) DPR，但由于一些患者的poly(GP) 水平接近背景，可能需要提高靈敏度。
3. 該研究報(bào)告了一種適合臨床試驗(yàn)的超靈敏腦脊液聚糖蛋白檢測方法的開發(fā)。能在絕大多數(shù)試驗(yàn)參與者中評估目標(biāo)參與度，包括低聚糖蛋白水平的參與者。

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