在我國，乳腺癌發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，是嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤。巨噬細胞是乳腺癌微環(huán)境的主要細胞類型。腫瘤相關巨噬細胞通常具有促癌和免疫抑制功能，與不良預后相關，但也有報道表明同一腫瘤內可能同時存在具有促癌和抗癌功能的不同巨噬細胞亞群。因此，本文研究者使用單細胞轉錄組測序技術分析了腫瘤相關巨噬細胞的異質性特征，并發(fā)現(xiàn)一種新的抗癌巨噬細胞亞群，為靶向巨噬細胞的癌癥治療提供了新的思路。

文章題目：Tissue-resident FOLR2+ macrophages associate with CD8+T cell infiltration in human breast cancer
中文題目：組織駐留型FOLR2+巨噬細胞與人乳腺癌中CD8+ T細胞浸潤有關
發(fā)表時間：2022年3月
期刊名稱：Cell
影響因子：41.582
實驗平臺：流式細胞分選技術、10x Chromium單細胞轉錄組測序、IHC、激光共聚焦顯微成像技術等
DOI：10.1016/j.cell.2022.02.021

研究思路

研究思路

研究內容
1、APOE表達鑒定乳腺癌中的TAMs
研究者使用一個未接受過治療的管腔型乳腺癌（BC）患者隊列樣品，分析了匹配的原發(fā)腫瘤中非轉移和轉移的淋巴結（LN）內的單核巨噬細胞數(shù)量，并發(fā)現(xiàn)癌轉移LNs中CD1c-CD14+單核細胞/巨噬細胞數(shù)量較非轉移LNs顯著增加（圖1A），CD14+細胞浸潤與LNs腫瘤侵襲程度有關（圖1B）。接下來，研究者從癌轉移LNs、原發(fā)腫瘤和血液中分離出單核巨噬細胞并進行單細胞轉錄組測序（圖1C），得到了約18000個髓系細胞并進行細胞注釋（圖1D和E）。此外，APOE同源表達選擇性地將TAM與CD14+單核細胞和CD1c+DCs區(qū)分出來（圖1F）。從蛋白表達水平上，利用染色實驗發(fā)現(xiàn)APOE和CCR2可以將巨噬細胞/TAMs與CD1c-CD14+細胞內的單核細胞區(qū)分開，隨著腫瘤負荷增加，CD14+細胞內APOE+巨噬細胞比例也隨之增加，而CCR2+單核細胞比例降低（圖1G）。綜上所述，研究者找到了APOE，作為鑒定管腔型BC原發(fā)腫瘤和癌轉移LNs中巨噬細胞的特異標志物。

Fig.1 APOE表達定義了乳腺癌中的腫瘤相關巨噬細胞

2、單細胞RNA測序揭示了兩種APOE+巨噬細胞亞群
通過對找到的APOE+TAMs進行亞亞群分析，得到了三個亞亞群，系統(tǒng)聚類分析發(fā)現(xiàn)三個亞亞群中0和1在轉錄上關系更近（圖2A和B）。利用SCENIC進一步探究巨噬細胞轉錄異質性發(fā)現(xiàn)0和1有約一半的共同調控子，而2則有一些獨特的調控子（圖2C）�；�因表達差異分析表明，FOLR2、SEPP1、SLC40A1、MRC1和LYVE1在2中高表達，而TREM2、SPP1、ISG15則在0和1中高表達（圖2D）。其中，FOLR2是2的定義marker，TREM2是0和1的定義marker�？傊�，APOE+巨噬細胞中包含2種細胞類型：TREM2+或FOLR2+巨噬細胞（圖2E）。然而，在TAMs的細胞表面未能檢測到TREM2蛋白的表達，不過在亞亞群1（Trem2high巨噬細胞）中發(fā)現(xiàn)CADM1的特異性表達，其染色也呈陽性（圖2F和G）。從原發(fā)癌和癌轉移LNs中分選出FOLR2+CADM1-和FOLR2lowCADM1+巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)前者呈典型的巨噬細胞形態(tài)并充滿空泡，而后者體積更小，形態(tài)更接近單核細胞（圖2G）。對FORL2+CADM1-巨噬細胞、FOLR2lowCADM1+巨噬細胞和CD14+CCR2+單核細胞進行bulk RNA測序，發(fā)現(xiàn)FOLR2+巨噬細胞與另外兩種細胞距離較遠，且高表達FOLR2、SEPP1、SLC40A1和LYVE1（圖2H-J）。這些結果表明，乳腺TAMs由兩種細胞群組成，它們可以通過TREM2/CADM1和FOLR2的互斥表達區(qū)分。

Fig.2 單細胞轉錄組測序揭示了兩個APOE+巨噬細胞亞群

3、FOLR2+巨噬細胞是組織駐留性巨噬細胞研究者結合近期研究結果和自己的發(fā)現(xiàn)，認為TREM2+CADM1+巨噬細胞來源于腫瘤發(fā)展過程中循環(huán)單核細胞的浸潤，而FOLR2+巨噬細胞的起源尚不清楚。為了解決這個問題，研究者利用質譜流式技術對健康組織和乳腺腫瘤病變組織中的FOLR2+巨噬細胞進行了定量，發(fā)現(xiàn)在APOE+巨噬細胞中，F(xiàn)OLR2+巨噬細胞富集在正常組織和癌旁中，并隨著腫瘤發(fā)展，其比例被FOLR2-巨噬細胞稀釋（包括TREM2+巨噬細胞）（圖3A），但由于正常組織和腫瘤中FOLR2+巨噬細胞在總活細胞比例中保持穩(wěn)定，說明在腫瘤病變中，F(xiàn)OLR2+巨噬細胞群體并沒有減少。通過對TCGA數(shù)據庫中不同亞型的BC樣本的分析，也在轉錄水平上證實了FOLR2+巨噬細胞在鄰近正常組織比腫瘤病變組織富集程度更高，IHC分析顯示FOLR2+巨噬細胞在BC各亞型中均有表達（圖3B和C）。此外，前面的研究中發(fā)現(xiàn)FOLR2+巨噬細胞特異性表達LYVE1和MRC1/CD206，這些都是血管周圍（PV）巨噬細胞的marker，共聚焦成像顯示FOLR2+CD206+巨噬細胞確實位于腫瘤和鄰近組織中CD31+血管附近（圖3D）。綜上所述，F(xiàn)OLR2+巨噬細胞是與健康乳腺（MG）相關的PV組織駐留巨噬細胞（TRM）。
接下來，研究者利用小鼠模型進行單細胞測序來分析巨噬細胞，共鑒定到3個巨噬細胞亞群，其中兩個表達Cadm1(0和1兩個亞群)（圖3E），第三個離散亞群（2號亞群）為Folr2+Mrc1+巨噬細胞，人和小鼠的FOLR2+巨噬細胞共同表達FOLR2、MRC1、LYVE1和MAF（圖3F）。為了探索人和小鼠FOLR2+巨噬細胞之間的相似性，研究者在單個細胞水平進行同源基因的相似性分析，證實了小鼠Folr2+巨噬細胞和人FOLR2+巨噬細胞的一致，說明FOLR2+巨噬細胞在小鼠和人管腔型乳腺癌之間是保守的（圖3G）。在健康（WT）、病變前、腫瘤性病變、早期癌和晚期癌小鼠中分析FOLR2+和CADM1+巨噬細胞動態(tài)變化。其中，F(xiàn)OLR2+巨噬細胞約占健康MG巨噬細胞總數(shù)的80%，并隨著腫瘤進展而逐漸減少，在晚期癌中達到最低值（圖3H）。根據上述結果，研究者得出結論FOLR2+巨噬細胞是一種在晚期癌癥中持續(xù)存在且進化上保守的TRM亞群。

Fig.3 FOLR2+ 巨噬細胞是組織駐留的巨噬細胞

4、FOLR2+巨噬細胞與BC患者的生存期增加相關
通常認為巨噬細胞促進腫瘤生長并抑制抗腫瘤免疫。因此，研究者接下來探求FOLR2+巨噬細胞是否同樣與BC患者較差的生存率有關。本研究中發(fā)現(xiàn)的三個巨噬細胞亞群（圖2A）均表達了C1QA、C1QB和C1QC，足以區(qū)分巨噬細胞和其他白細胞譜系。FOLR2、SEPP1 和 SLC40A1能將FOLR2+巨噬細胞和其他巨噬細胞與白細胞譜系區(qū)分開來（圖4A和B）。生存分析發(fā)現(xiàn)最高水平的巨噬細胞浸潤與較差的總生存期相關，但是高水平表達的FOLR2+巨噬細胞特征基因則與總生存期增加相關，在不同亞型BC患者隊列中也能發(fā)現(xiàn)這一點（圖4C）。此外，通過染色成像計算FOLR2+巨噬細胞密度，發(fā)現(xiàn)其密度與患者生存期呈正相關（圖4D和E）。上述這些結果表明 FOLR2基因特征和 FOLR2+巨噬細胞豐度與BC患者的更好預后相關。

Fig.4 FOLR2+巨噬細胞與乳腺癌患者的生存期增加相關

5、FOLR2+巨噬細胞存在于腫瘤基質中，并且在空間上與癌癥中的TREM2+巨噬細胞分離除了乳腺癌，研究者繼續(xù)探究FOLR2+巨噬細胞在不同腫瘤中是否存在，為此分析了80多個腫瘤切片中FOLR2+細胞的分布，并在這些癌癥中發(fā)現(xiàn)了FOLR2+巨噬細胞，其持續(xù)存在于腫瘤基質內，很少浸潤腫瘤巢（圖5A）。對多種腫瘤連續(xù)切片進行FOLR2和TREM2的染色分析，發(fā)現(xiàn)TREM2+巨噬細胞在腫瘤巢附近浸潤或分布，而FOLR2+巨噬細胞主要位于腫瘤基質。某些癌癥中TREM2+巨噬細胞同時存在于腫瘤基質和腫瘤巢，而FOLR2+巨噬細胞仍位于腫瘤基質中（圖5B）。為了測試腫瘤基質中巨噬細胞豐度是否與臨床結果有關，分析了一個BC瘤周基質區(qū)域基因芯片數(shù)據集結果，發(fā)現(xiàn)FOLR2特征基因集與更好的生存期密切相關，低FOLR2則比較差，與TREM2相反（圖5D）。研究者得出結論FOLR2+巨噬細胞和TREM2+巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中的空間分布彼此分離，它們在腫瘤基質中的豐度與BC患者不同的臨床結果有關。

Fig.5 FOLR2+巨噬細胞與TREM2+巨噬細胞在空間上分離

6、FOLR2+巨噬細胞在CD8+T細胞浸潤的腫瘤中富集，并與癌癥中的淋巴聚集體共定位利用FOLR2特征基因集或FOLR2表達來將FOLR2+巨噬細胞的豐度與腫瘤微環(huán)境中的其他免疫和基質細胞類型相關聯(lián)，結果表明FOLR2特征基因集（或FOLR2）與CD8+ T細胞、DC、B細胞和三級淋巴結構（TLSs）等已知的抗腫瘤免疫因子呈正相關（圖6A）。水平最高的FOLR2表達與多淋巴細胞譜系的協(xié)調浸潤和TLS的基因特征一致（圖6B）。腫瘤中的FOLR2表達與各種免疫通路之間存在很強的相關性。與CDAM1+TREM2+巨噬細胞相比，在bulk RNA測序數(shù)據集中，對FOLR2+巨噬細胞富集了趨化性和免疫反應調節(jié)功能模塊通路，表明FOLR2+巨噬細胞是抗腫瘤免疫啟動的免疫環(huán)境的一部分（圖6C）。因為CD8+ T細胞在包括BC在內的各種癌癥類型中與更好的生存期有關，因此研究者探求FOLR2+巨噬細胞是否與腫瘤浸潤性CD8+T細胞互作。通過對腫瘤切除標本進行觀察，發(fā)現(xiàn)CD31+血管附近的FOLR2+巨噬細胞與CD8+T細胞聚集體密切相關（圖6D）。FOLR2+巨噬細胞含量高的腫瘤中CD8+T細胞密度顯著高于FOLR2+巨噬細胞含量低的腫瘤（圖6E）。這些結果說明基質相關的FOLR2+巨噬細胞是腫瘤巢附近淋巴聚集體的結構成分。
為了進一步研究這兩種細胞類型是否能有效的結合，研究者對BC病變樣品進行共聚焦實時成像，針對CD8、FOLR2、EPCAM來染色腫瘤病灶的CD8+T細胞、FOLR2+巨噬細胞和EPCAM+腫瘤細胞，隨后通過延時顯微鏡對細胞動力學成像，發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞降低了它們的速度并與FOLR2+巨噬細胞建立了長期聯(lián)系，這與FOLR2缺失的腫瘤區(qū)域中CD8+T細胞的高流動性形成了鮮明對比（圖6F）。這些結果揭示CD8+T細胞與FOLR2+巨噬細胞建立了長期的相互作用，這一行為可能促進T細胞的激活。與此結果一致，腫瘤全轉錄組中FOLR2表達與控制T細胞毒性功能的基因呈正相關，但與T細胞功能障礙的基因無關（圖6G）。總之，腫瘤浸潤性CD8+T細胞主動與FOLR2+巨噬細胞結合，這種相互作用與CD8+T細胞的激活和患者的生存呈正相關。

Fig.6 FOLR2+巨噬細胞在浸潤腫瘤的CD8+T細胞中富集，并與淋巴聚集體共定位
7、FOLR2+巨噬細胞能夠響應腫瘤生長并獲得T細胞啟動能力
為了解析FOLR2+巨噬細胞的功能特征，研究者利用bulk RNA測序技術來分析健康和中小型腫瘤小鼠乳腺中分離得到的FOLR2+巨噬細胞。主成分分析結果表明從乳腺腫瘤中分離的FOLR2+巨噬細胞以腫瘤大小依賴性方式改變其轉錄組表達譜（圖7A）。乳腺癌和健康小鼠FOLR2+巨噬細胞中有1356個差異表達基因（DEG），其中腫瘤的表達參與免疫系統(tǒng)正調節(jié)如B、T細胞趨化因子等、黏附分子、溶酶體蛋白基因。而健康小鼠則富含調節(jié)代謝過程的基因，說明FOLR2+TRMs響應腫瘤發(fā)展（圖7B和C）。為了測試乳腺癌FOLR2+和CADM1+巨噬細胞是促炎性（M1）還是抗炎性（M2）巨噬細胞，分析了這兩個細胞群M1或M2特征基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)這兩個細胞群均表達M1或M2的部分基因，說明腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞激活不符合體外M1/M2極化模型（圖7D）�？乖�特異性T細胞啟動實驗發(fā)現(xiàn)FOLR2+巨噬細胞表現(xiàn)出更強的誘導初始T細胞激活、擴增、多功能性和細胞毒性的能力。此外，從健康MG中分離的FOLR2+巨噬細胞不能有效激活CD8+T細胞，而從乳腺癌中分離出來的FOLR2+巨噬細胞可以誘導T細胞擴增和分化（圖7E和F）。這些結果證實了FOLR2+巨噬細胞在腫瘤發(fā)展過程中被激活，并獲得了激活CD8+T細胞的能力。綜上所述，研究者提供了FOLR2+巨噬細胞不像免疫抑制細胞的證據。相反，腫瘤相關的FOLR2+巨噬細胞是強大的抗原提呈細胞，具有觸發(fā)CD8+T細胞激活的功能。

Fig.7 FOLR2+巨噬細胞響應腫瘤生長并獲得啟動T細胞的能力

主要結論

本研究鑒定到一種在健康乳腺和乳腺癌原發(fā)腫瘤中存在的FOLR2+組織駐留巨噬細胞群。

1. FOLR2+巨噬細胞位于腫瘤基質的血管周圍區(qū)域，在那里它們與CD8+T細胞相互作用。
2. FOLR2+巨噬細胞在體外可有效激活效應CD8+T細胞。
3. 腫瘤中FOLR2+巨噬細胞的密度與患者較好的生存期呈正相關。

綜上所述，研究者揭示了腫瘤相關巨噬細胞亞群的特定作用，并為在基于巨噬細胞的癌癥治療研究中的亞群靶向治療干預思路鋪平了道路。

參考文獻
Nalio Ramos, Rodrigo et al.“Tissue-resident FOLR2+ macrophages associate with CD8+ T cell infiltration in human breast cancer.”Cell vol. 185,7 (2022): 1189-1207.e25.