文章標題：Effect of Fushengong Decoction on PTEN/PI3K/AKT/NF-κB Pathway in Rats With Chronic Renal Failure via Dual-Dimension Network Pharmacology Strategy

發(fā)表期刊：Frontiers in Pharmacology

影響因子：5.81

合作單位：重慶醫(yī)科大學

百趣生物提供服務：中藥非靶標代謝組學

1研究背景
慢性腎功能衰竭（CRF）是一種由多種原因?qū)е履I功能進行性喪失并最終導致腎功能衰竭的疾病。近年來，CRF因其病情危重、發(fā)病率和死亡率高，已成為不可忽視的重大公共衛(wèi)生問題。研究發(fā)現(xiàn)CRF的發(fā)病機制可能與遺傳因素、血液動力學變化、炎癥因子、氧化應激等密切相關。CRF的主要治療方法是腎移植和血液透析，但療效較差。

復腎湯（FSGD）是國醫(yī)大師郭子光教授經(jīng)60余年的臨床創(chuàng)制的經(jīng)驗方。其作用是補腎、活血、化濁，改善腎功能和腎纖維化。本文作者課題組先前的研究表明FSGD可以顯著降低α-SMA和TGF-β1的表達水平，從而減少腎纖維化。盡管FSGD在CRF中的臨床應用已經(jīng)得到驗證，但由于其成分和靶點的復雜性，其治療CRF的機制尚不清楚。

重慶醫(yī)科大學黃學寬課題組羅洪玉在相關研究中，利用網(wǎng)絡藥理學和UHPLC-MS/MS技術(shù)，對FSGD治療CRF的有效成分及其作用機制進行預測，并結(jié)合體內(nèi)實驗進一步證實PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學信號通路是FSGD治療GRF的關鍵通路。
 

 

圖1. FSGD在GRF中的研究示意圖

2研究設計
將雄性SD大鼠(200±20g)隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（NDQ）、FSGD組。用腺嘌呤建立CRF動物模型，然后FSGD治療4周。收集血清和尿液樣本，檢測代謝生化指標以評估腎功能。通過對腎臟組織進行蘇木精-伊紅染色和馬松染色實驗來評價腎臟病理損傷程度。采用免疫組織化學和蛋白印跡分析檢測蛋白的表達水平。

3研究結(jié)果
（1）FSGD的藥用活性成分及相關靶點
從TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到121個FSGD藥用成分。以OB≥30%、HL≥4和DL≥0.18為篩選標準。將符合篩選標準的藥用成分進行進一步分析，在FSGD中預測得到893個假定靶點。

（2）CRF靶點預測和共有靶點
從GeneCards數(shù)據(jù)庫中總共獲得8596個CRF 靶點。其中1115個靶點可以作為候選治療靶點。將 FSGD 的靶點與 CRF 的靶點進行比對并繪制維恩圖，發(fā)現(xiàn)192 個共有靶點，例如 EGFR、TNF和AKT1(圖2A)。第一維共同靶點被認為是FSGD 抗CRF的潛在治療靶點。

（3）GO和KEGG富集分析
經(jīng)GO分析，發(fā)現(xiàn)炎癥反應、凋亡信號通路和細胞外基質(zhì)參與了CRF的過程(圖2B)。在KEGG通路富集化分析位于前15的信號通路中，PTEN/PI3K/AKT/NF-κB參與慢性腎功能衰竭過程中細胞的凋亡與增殖、炎癥和纖維化(圖2C)。先前研究表明，F(xiàn)SGD可通過RAS系統(tǒng)中的ACE-Ang II-AT1R軸改善CRF大鼠的腎功能，抑制腎纖維化，而RAS與肝臟中的PI3K/AKT通路密切相關。據(jù)此，作者推測FSGD治療CRF的機制可能是通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT/NF-κB信號通路。

（4）FSGD治療GRF理論活性成分一維網(wǎng)絡可視化
利用192個共有靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，PPI網(wǎng)絡分析表明STAT3,PIK3CA,PIK3R1,MAPK1,SRC和AKT1是PPI網(wǎng)絡中前六大靶基因。其中PIK3CA,PIK3R1和AKT1與PTEN/PI3K/AKT/NF-κB通路有關，AKT1是關鍵基因(圖2D-E)
 

圖2. FSGD在GRF中的第一維網(wǎng)絡藥理學研究

（5）UHPLC-MS/MS檢出有效成分的第二維網(wǎng)絡藥理學分析
FSGD正/負總離子流圖展示了該湯劑所有化合物的化學成分，經(jīng)過與中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫收集的有效化合物比對出40種化合物。使用前面的篩選標準篩選出9個候選化合物，并預測了它們的靶標(圖3A-C)，然后進行了第二維網(wǎng)絡藥理學分析。PPI結(jié)果表明，AKT1是該網(wǎng)絡的最高靶基因和中心基因。此外，GO、KEGG和PPI的結(jié)果都參與了PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學通路(圖4A-D)。
 

圖3. 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)鑒定FSGD水提取物溶液中的化學成分
 

圖4. CRF中FSGD檢測成分的第二維網(wǎng)絡藥理學研究

（6）FSGD對腎功能的保護作用
通過24h尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮檢測腎功能。與正常組相比，模型組大鼠24h尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮均顯著升高，表明本實驗成功建立了CRF大鼠模型。然而，F(xiàn)SGD和NDQ顯著降低了這些CRF指標，且FSGD組改善顯著(圖5A-C)。結(jié)果表明，F(xiàn)SGD可以改善CRF癥狀和腎功能。

 

圖5. FSGD對腎病理性損傷和腎纖維化的影響

（7）FSGD減輕腎臟病理損傷和腎纖維化
與正常組相比，模型組大鼠腎臟病理形態(tài)發(fā)生顯著改變，腎小管擴張或萎縮，大量炎性細胞浸潤，腺嘌呤結(jié)晶沉積阻塞管腔。同時，NDQ和FSGD可減輕上述病理損傷。經(jīng)Masson染色，與對照組相比，模型組大鼠腎組織中膠原纖維顯著累積，F(xiàn)SGD顯著改善腎纖維化(圖5D-E)。

（8）FSGD對慢性腎衰模型PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的影響
免疫組化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組PTEN表達顯著降低，而FSGD組PTEN表達顯著升高(圖6A-B)，表明PTEN表達主要受PI3K/AKT通路調(diào)控。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，模型組腎組織中PI3K、AKT、p-AKT表達均顯著升高，F(xiàn)SGD和NDQ顯著上調(diào)PTEN的表達，提示降低PI3K、AKT和p-AKT的表達是通過抑制 PI3K/AKT通路實現(xiàn)的(圖6C-E)。

為了驗證上述假設，作者使用蛋白印跡分析進一步檢測了腎臟中的關鍵因子PTEN及其上游因子PI3K和p-PI3K的蛋白水平。與正常組比較，模型組大鼠PTEN表達顯著降低，F(xiàn)SGD和NDQ治療后PTEN表達顯著增加(圖7A-D)。此外，在模型組PI3K和p-PI3K的表達顯著增加，而FSGD和NDQ處理組與模型組相比，PI3K和p-PI3K的表達顯著降低(圖7A-D)。

為了進一步揭示FSGD在PTEN/PI3K/AKT/NF-κB通路中的作用機制，作者測定了下游因子AKT、p-AKT和NF-κB，因為這些因子在腎纖維化中起著重要作用。與正常組相比，模型組腎組織中AKT、p-AKT和NF-κB的表達顯著增加，表明腎組織中PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學通路被激活，而FSGD和NDQ處理后腎組織中AKT、p-AKT和NF-κB的表達顯著降低(圖7E-H)，說明FSGD和NDQ處理能夠抑制PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學通路。
 

 

圖6. FSGD對PI3K/AKT通路的影響
 

圖7. PI3K/AKT通路蛋白分析
 

圖8. FSGD治療CRF分子調(diào)控示意圖

4總結(jié)
綜上所述，作者本研究中進行系統(tǒng)地鑒定了FSGD中包含的成分，并通過二維網(wǎng)絡藥理學和體內(nèi)實驗研究了FSGD治療CRF的分子調(diào)控機制。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)SGD減輕CRF大鼠腎纖維化和腎損傷的作用可能與抑制PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學信號通路有關。網(wǎng)絡藥理學是探索復雜疾病機制和藥物多靶點的新策略，可以幫助中藥研究人員更準確地找到最可能的藥物治療機制，為進一步的實驗提供更充分的理論基礎。

文/阿趣代謝組學