血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)活性熒光檢測(cè)試劑盒(ACE2 Activity Fluorometric Assay Kit)，是一種用熒光法快速高靈敏檢測(cè)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (Angiotensin I Converting Enzyme 2 or Angiotensin II Converting Enzyme，簡(jiǎn)稱(chēng)ACE2)活性的試劑盒。
 

2019年底由新型冠狀病毒引起的肺炎疫情，從2020年初開(kāi)始在全球大流行，感染病例快速上升，引發(fā)全球關(guān)注。該病毒被世界衛(wèi)生組織(WHO)命名為2019-nCoV，被國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。由新型冠狀病毒導(dǎo)致的疾病，被世界衛(wèi)生組織命名為2019冠狀病毒疾病 (Corona Virus Disease 2019, COVID-19)，通常稱(chēng)為新型冠狀病毒肺炎，簡(jiǎn)稱(chēng)“新冠肺炎”。
 

ACE2是一種含鋅離子的金屬羧肽酶(metallocarboxypeptidase)，其結(jié)構(gòu)包括一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)含有HEXXH鋅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的金屬蛋白酶活性位點(diǎn)。ACE2是人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin I Converting Enzyme，簡(jiǎn)稱(chēng)ACE或ACE1)的同源基因，是在肺、心臟、腎臟和腸等組織中高表達(dá)的跨膜糖蛋白，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)的重要成員。ACE2催化Angiotensin I剪切生成九肽的血管擴(kuò)張劑Ang 1-9，也可以催化Angiotensin II剪切生成七肽的血管擴(kuò)張劑Ang 1-7，在調(diào)節(jié)血壓、體液平衡、炎癥、細(xì)胞增殖、肥大和纖維化的方面具有重要作用。同時(shí)，ACE2的組織和細(xì)胞的特異性表達(dá)提示其在調(diào)節(jié)心血管和腎臟功能以及生育方面發(fā)揮重要作用。此外，ACE2是冠狀病毒SARS-CoV、SARS-CoV-2 (2019-nCoV)以及HCoV-NL63的受體。SARS-CoV及SARS-CoV-2通過(guò)其Spike蛋白受體結(jié)合域(receptor binding domain, RBD)與ACE2的肽酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，參與病毒的感染過(guò)程。ACE2與SARS-CoV-2 Spike蛋白的親和力是SARS-CoV Spike蛋白的10-20倍。
 

ACE2在新冠病毒引起的疾病中，扮演了重要而復(fù)雜的角色。一方面，ACE2是新冠病毒進(jìn)入細(xì)胞所識(shí)別的受體，在小鼠模型中，ACE2表達(dá)水平越高，感染就會(huì)越嚴(yán)重，因此ACE2起著幫助新冠病毒感染細(xì)胞并得以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的“導(dǎo)火線(xiàn)”作用；另一方面，ACE2有一定的保護(hù)作用，如果使ACE2表達(dá)水平降低，小鼠的肺部損傷就會(huì)急劇惡化。因此，ACE2為預(yù)防和治療新冠肺炎提供了新的研究方向，ACE2蛋白作為新冠病毒感染人體、進(jìn)入細(xì)胞的重要靶點(diǎn)已經(jīng)越來(lái)越受到關(guān)注。
 

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)活性熒光檢測(cè)試劑盒采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其檢測(cè)原理如下。
 

MCA是熒光供體(Donor)，Dnp是熒光受體(Acceptor)或稱(chēng)為淬滅基團(tuán)(Quencher)，這兩個(gè)熒光基團(tuán)的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離合適時(shí)(一般7-10nm)，熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。MCA和Dnp被連接到ACE2蛋白酶的底物(Substrate)的兩端。當(dāng)ACE2沒(méi)有切割底物時(shí)，兩個(gè)基團(tuán)足夠接近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，即Dnp可淬滅MCA的熒光而導(dǎo)致檢測(cè)不到熒光；當(dāng)該底物被ACE2切割后，多肽的首尾兩端分離，兩個(gè)基團(tuán)分開(kāi)，MCA的熒光不再被Dnp淬滅，即可檢測(cè)到MCA的熒光，這樣通過(guò)熒光檢測(cè)就可以非常靈敏地檢測(cè)ACE2蛋白酶的酶活性。MCA的最大激發(fā)波長(zhǎng)為325nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為393nm。
 

圖1. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)活性熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理圖。

本試劑盒檢測(cè)靈敏度高，線(xiàn)性范圍寬，樣品用量少。96孔板中通常1-10μl細(xì)胞或組織樣品足夠用于A(yíng)CE2酶活性檢測(cè)。
 

本試劑盒使用靈活，檢測(cè)速度快，適用范圍廣。本試劑盒中提供了ACE2酶陽(yáng)性對(duì)照(Positive Control)，便于檢測(cè)體系的建立。本試劑盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血漿以及肺、腸、肝臟等組織或細(xì)胞樣品的檢測(cè)。不僅適合少量樣本的檢測(cè)，也非常適合高通量篩選(high-throughput screening)的自動(dòng)化操作系統(tǒng)。本試劑盒采用一步法檢測(cè)，簡(jiǎn)單快速，全程約0.5-1h即可完成。

本試劑盒提供的Lysis Buffer通用性強(qiáng)，可直接用于裂解細(xì)胞或動(dòng)物組織樣品用于檢測(cè)ACE2酶活性。
 

本試劑盒內(nèi)提供了MCA Standard，在0.2-50μM范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。可以通過(guò)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出樣品中ACE2的活性。
 

用于96孔板檢測(cè)時(shí)，本試劑盒小包裝P0319S可以進(jìn)行100次檢測(cè)，中包裝P0319M可以進(jìn)行500次檢測(cè)。
 

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，一年有效。其中P0319-4 Substrate、P0319-5 MCA Standard (10mM)需避光保存。

注意事項(xiàng)：

Assay Buffer、Substrate和MCA Standard (10mM)需完全解凍并平衡至室溫后再使用，否則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。Positive Control (10X)使用時(shí)應(yīng)置于冰上，使用完畢后各試劑應(yīng)立即按照試劑盒要求的條件保存。
 

如果使用本試劑盒提供的Lysis Buffer制備樣品，并且加入的樣品量在本試劑盒的推薦范圍內(nèi)，可以確保反應(yīng)體系的pH值在適宜的范圍內(nèi)。如果使用自行配制的裂解液，請(qǐng)確保加入樣品后反應(yīng)體系的pH值在6.5-7.0之間，或者確保樣品的pH值在6.5-7.0之間，否則可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的信號(hào)值和穩(wěn)定性。
 

體積較小的試劑首次使用時(shí)建議先離心數(shù)秒使液體沉降于管底，然后再使用。結(jié)凍的試劑必須完全融化并混勻后使用。
 

盡管經(jīng)測(cè)試本試劑盒中的Positive Control (10X)反復(fù)凍融5次對(duì)活性基本沒(méi)影響，為取得良好的檢測(cè)效果，建議第一次使用時(shí)適當(dāng)分裝保存。Positive Control (10X)融解后可能會(huì)有少量不溶物，屬正常現(xiàn)象。盡量充分溶解后，離心取上清使用即可。
 

雖然本試劑盒中的ACE2底物有很高的特異性，但仍然有可能有一些蛋白酶可以切割本底物，建議進(jìn)一步使用ACE2特異性抑制劑MLN-4760 (SF1197)進(jìn)行驗(yàn)證。
 

檢測(cè)時(shí)建議使用96孔黑板，推薦選購(gòu)全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(FCP966)。
 

細(xì)胞、組織等裂解樣品如果置于4℃保存，用于A(yíng)CE2活性檢測(cè)時(shí)，保存的時(shí)間不應(yīng)超過(guò)2天，否則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通常細(xì)胞、組織等裂解樣品宜在-20℃保存，-80℃保存更佳。
 

本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
 

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

​使用說(shuō)明：
1.樣品的準(zhǔn)備。
a.血液樣品的準(zhǔn)備。
對(duì)于血清樣品，將全血在常溫如25℃下放置30分鐘至2小時(shí)，不要?jiǎng)×覔u晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000×g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀；對(duì)于血漿樣品，將全血用肝素或者EDTA進(jìn)行抗凝，4℃約1000-2000×g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取沉淀。血清和血漿都需置于冰上，如果不能立即檢測(cè)，也可以分裝并短期保存于-20℃或-80℃。對(duì)于凍存的樣品，在檢測(cè)前解凍后冰浴存放備用，使用前必須混勻。
b.細(xì)胞或組織樣品的準(zhǔn)備。
對(duì)于培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，PBS (C0221A)洗滌一次并吸凈殘留液體。對(duì)于培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，先適當(dāng)離心(如100-500×g, 5分鐘)收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，棄上清并吸凈殘留液體。按照每100萬(wàn)細(xì)胞加入100-200μl Lysis Buffer的比例加入Lysis Buffer，適當(dāng)吹打，冰浴5-10分鐘以充分裂解細(xì)胞。4℃約12,000×g離心3-5分鐘，取上清用于后續(xù)檢測(cè)。對(duì)于組織樣品，按照每10mg組織加入100μl Lysis Buffer的比例進(jìn)行勻漿。4℃約12,000×g離心3-5分鐘，取上清用于后續(xù)檢測(cè)。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制備好的細(xì)胞或組織樣品如果不能立即檢測(cè)，可以-20℃或-80℃凍存。

2.試劑盒的準(zhǔn)備。
將Assay Buffer、Substrate和MCA Standard等試劑平衡至室溫后分別混勻備用。Positive Control (10X)存放于冰浴備用，使用完畢后宜立即按照試劑盒要求的條件保存。

3.陽(yáng)性對(duì)照的準(zhǔn)備。
取適量的Positive Control (10X)并加入Assay Buffer對(duì)Positive Control (10X)進(jìn)行10倍稀釋。例如，取5μl Positive Control (10X)，加入45μl Assay Buffer，混勻，即得50μl Positive Control (1X)。96孔板檢測(cè)時(shí)，通常每孔10μl Positive Control (1X)即可。

4.MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的設(shè)置。
取2μl MCA Standard (10mM)，加入198μl Assay Buffer，混勻，即為200μl 100μM的MCA溶液，分別取0、2.5、5、10、20、30、40、50μl的100μM MCA溶液加入96孔板中，并用Assay Buffer補(bǔ)足至100μl，此時(shí)，MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的各孔MCA濃度和物質(zhì)的量分別為0、2.5、5、10、20、30、40、50μM或0、0.25、0.5、1、2、3、4、5nmol。也可自行設(shè)置適宜的MCA濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的設(shè)定。

5.檢測(cè)體系的設(shè)置：
參照下表依次加入試劑盒各組分及樣品。初次檢測(cè)時(shí)，待測(cè)樣品可以稀釋一系列濃度梯度，以確保最終檢測(cè)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍內(nèi)。待測(cè)樣品的稀釋倍數(shù)記為dil。

注：為獲得更加可靠的檢測(cè)結(jié)果，推薦每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

6.檢測(cè)。
a.振蕩混勻1-2分鐘，確保混合充分。
b.除MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)外每孔加入2μl Substrate，混勻。注：加入Substrate后反應(yīng)會(huì)立即開(kāi)始，如果孔數(shù)較多的情況下，建議在低溫或使用排槍操作以減小各孔間加入Substrate的時(shí)間差而導(dǎo)致的誤差，混勻操作可在培養(yǎng)板振蕩器上進(jìn)行。
c.混勻后立即使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光測(cè)定。設(shè)置熒光酶標(biāo)儀溫度為37℃，激發(fā)波長(zhǎng)為325nm、發(fā)射波長(zhǎng)為393nm，每5分鐘或10分鐘讀取一次數(shù)值。
注1：連續(xù)測(cè)定的時(shí)間可以根據(jù)待測(cè)樣品中ACE2的酶活性進(jìn)行調(diào)整，但是需確保獲得6個(gè)點(diǎn)以上的數(shù)據(jù)。對(duì)于A(yíng)CE2的酶活較高的樣品，建議測(cè)定總時(shí)間為20分鐘或30分鐘，對(duì)應(yīng)的測(cè)定間隔時(shí)間設(shè)為2分鐘或5分鐘；對(duì)于A(yíng)CE2的酶活很低的樣品，可以延長(zhǎng)測(cè)定總時(shí)間為1至2小時(shí)，對(duì)應(yīng)的測(cè)定間隔時(shí)間設(shè)為10或20分鐘。
注2：如果熒光酶標(biāo)儀沒(méi)有溫控功能，也可以在室溫測(cè)定，但這樣檢測(cè)出來(lái)的是室溫條件下的酶活性，此時(shí)酶活性可能會(huì)偏低一些，不同的實(shí)驗(yàn)條件偏低的程度會(huì)有所不同。

7.計(jì)算。
a.計(jì)算每個(gè)樣品孔和空白對(duì)照孔的平均熒光值，可分別記錄為RFU空白對(duì)照、RFU陽(yáng)性對(duì)照和RFU待測(cè)樣品。RFU，Relative Fluorescence Unit。選取待測(cè)樣品組MCA熒光強(qiáng)度呈線(xiàn)性關(guān)系的時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)用于分析，記錄呈線(xiàn)性關(guān)系的時(shí)間間隔為T(mén)，時(shí)間間隔T內(nèi)的熒光強(qiáng)度變化量為ΔRFU，即ΔRFU= RFU待測(cè)樣品(Time b) - RFU待測(cè)樣品(Time a)。
b.也可以直接比較各個(gè)樣品在一定時(shí)間內(nèi)的ΔRFU而確定樣品的ACE2相對(duì)活性，但須確保最終時(shí)間點(diǎn)時(shí)RFU讀數(shù)未達(dá)平臺(tái)。
c.也可將標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)各孔的熒光值減去標(biāo)準(zhǔn)品零濃度孔的熒光值，建立MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將ΔRFU代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即可算出在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)樣品中MCA的生成量(記錄為A)。MCA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)請(qǐng)參考圖2A，MCA在0.02-5nmol (即0.2-50μM)范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。ACE2蛋白酶活性的計(jì)算公式如下：
ACE2 Activity (nmol/min/mg或U/mg) = A× dil/ (Vsample × T × C)
注：Vsample為檢測(cè)時(shí)待測(cè)樣品的體積(Vsample=10μl =0.01ml)；
A為步驟7c根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定的MCA的生成量(nmol)；
dil為步驟5中樣品稀釋倍數(shù)；
C為樣品蛋白濃度(mg/ml，檢測(cè)步驟參考BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒或去垢劑兼容型的Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒)；
T為步驟7a中反應(yīng)時(shí)間(min)。
酶活力單位的定義為：溫度37℃條件下，每分鐘催化生成1nmol MCA酶量定義為一個(gè)單位(Unit, U)。
d.雖然本試劑盒中的ACE2底物已經(jīng)比較特異，但仍然有可能有一些蛋白酶可以切割本底物，建議進(jìn)一步使用ACE2特異性抑制劑MLN-4760 (SF1197)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)活性熒光檢測(cè)試劑盒的MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和對(duì)ACE2陽(yáng)性對(duì)照及組織樣品的檢測(cè)效果圖。A. 本試劑盒的MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)示意圖。B. 不同量的ACE2 Positive Control (1X)酶切底物，生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度示意圖。C. 小鼠不同組織的ACE2酶活性檢測(cè)效果及MLN-4760的抑制效果�？偟鞍琢慷紴�10μg，抑制劑為MLN-4760 (SF1197)，終濃度為500nM)。D. ACE2 Positive Control (1X，10μl)及抑制劑MLN-4760 (終濃度為500nM)在293T細(xì)胞裂解液中的檢測(cè)效果(總蛋白量為22μg)。實(shí)際檢測(cè)數(shù)據(jù)會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。