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文獻(xiàn)精讀第31期

文章概述
疼痛是機(jī)體的一種預(yù)警系統(tǒng)，能夠保護(hù)生物體免受真實(shí)或潛在的組織損傷。在過度疼痛的情況下，由于內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的存在，這種不愉快的感覺可以有效地被控制。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)源性鎮(zhèn)痛的失敗可能是一些病理性疼痛超敏反應(yīng)的基礎(chǔ)，但其潛在機(jī)制仍不清楚。2022年7月27日，法國波爾多大學(xué)的研究人員在《Science Advances》雜志上發(fā)表題為“Switch of serotonergic descending inhibition into facilitation by a spinal chloride imbalance in neuropathic pain”的文章。在該研究中，作者通過光遺傳學(xué)技術(shù)來調(diào)控Naïve和神經(jīng)病理性疼痛動物的5-HT下行通路，揭示了內(nèi)源性血清素源性疼痛調(diào)節(jié)不穩(wěn)定的機(jī)制。以已知的投射到脊髓背角（dorsal horn of the spinal cord, DHSC）的中縫核（Nucleus Raphe magnus, RMg）血清素能（5-HT）神經(jīng)元為目標(biāo)。作者發(fā)現(xiàn)，這一特定群體可通過激活局部脊髓抑制性中間神經(jīng)元來介導(dǎo)下行抑制。在神經(jīng)損傷的動物中，由于脊髓氯失調(diào)，這種下行抑制轉(zhuǎn)變?yōu)橄滦幸谆�。通過使脊髓氯穩(wěn)態(tài)正常化可以恢復(fù)5-HT神經(jīng)元的下行抑制，并使得5-HT再攝取抑制劑（Selective Serotonin Reuptake Inhibitors, SSRIs）能夠?qū)ι窠?jīng)病理性疼痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果。該研究結(jié)果提示了一個治療神經(jīng)病理性疼痛的新途徑。
 

核心觀點(diǎn)

1、下行的RMg 5-HT神經(jīng)元在Naïve小鼠中具有鎮(zhèn)痛作用，而在神經(jīng)病理性疼痛模型小鼠中則進(jìn)一步促進(jìn)痛覺過敏；

2、脊髓KCC2功能低下使得RMg 5-HT神經(jīng)元的疼痛下行抑制轉(zhuǎn)變?yōu)橄滦幸谆�；KCC2增強(qiáng)子可恢復(fù)5-HT介導(dǎo)的下行抑制和鎮(zhèn)痛；

3、結(jié)合SSRIs和KCC2增強(qiáng)子可以有效的緩解神經(jīng)損傷引起的痛覺過敏。

 

研究結(jié)果分析

1. RMg 5-HT神經(jīng)元的光遺傳激活導(dǎo)致脊髓5-HT選擇性的釋放

為了明確了RMg 5-HT神經(jīng)元在傷害性信號傳遞中的作用。作者首先通過轉(zhuǎn)基因小鼠確定了5-HT神經(jīng)元在DHSC的淺表和深層中存在神經(jīng)投射。隨后，作者通過病毒注射的方法在5-HT神經(jīng)元中表達(dá)ChR2蛋白。三周后，ChR2在RMg的5-HT神經(jīng)元的胞體以及DHSC的投射中都有表達(dá)。全細(xì)胞膜片鉗記錄顯示，5-HT神經(jīng)元動作電位能夠忠實(shí)地被光刺激所觸發(fā)。利用高效液相色譜對DHSC進(jìn)行測量，作者觀察到光刺激激活5-HT神經(jīng)元引起了DHSC中5-HT水平的顯著增加。
 

2. 脊髓中RMg 5-HT神經(jīng)末梢的光遺傳激活產(chǎn)生陣痛作用
然后，作者在注射部位上方（RMg）對5-HT神經(jīng)元進(jìn)行了光遺傳刺激。結(jié)果顯示，激活RMg 中的5-HT神經(jīng)元對動物的機(jī)械痛和熱痛均產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抑制作用。為了聚焦于投射到DHSC的下行通路，作者在脊髓上方對5-HT神經(jīng)末梢進(jìn)行光遺傳激活，觀察到了與上述相同的結(jié)果，表明5-HT誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛是由于DHSC中的5-HT神經(jīng)投射激活產(chǎn)生的。
 

 

3. RMg 5-HT神經(jīng)元能夠抑制脊髓痛覺
為了證實(shí)這種鎮(zhèn)痛作用是由于直接調(diào)控了DHSC中傷害性信息傳遞，作者進(jìn)行了在體電生理記錄。作者首先評估了光遺傳刺激5-HT神經(jīng)元的整體后果，在光遺傳刺激下，小鼠的痛覺場電位（Nociceptive field potentials, NFPs）降低，這種效應(yīng)在雄性和雌性中是相同的，證實(shí)了5-HT誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛是由于改變了DHSC中的傷害感受傳遞。為了確定痛覺信息的減少是否局限于DHSC水平，作者記錄了投射之外的DHSC深部神經(jīng)元，記錄限制在廣動力范圍神經(jīng)元中（Wide Dynamic Range neurons, WDRs)，這些神經(jīng)元高度收斂，并表現(xiàn)出明顯的c成分（即在相應(yīng)的感受域受到超閾值電刺激后出現(xiàn)延遲反應(yīng)，可作為痛覺傳遞的讀出）。在光遺傳刺激期間，作者觀察到c-纖維范圍內(nèi)的動作電位數(shù)量減少，這種下降在雄性和雌性動物中一致。
 

 

4.RMg 5-HT的鎮(zhèn)痛作用于脊髓局部GABA能/甘氨酸能神經(jīng)元

隨后，作者進(jìn)一步確定了參與這種鎮(zhèn)痛的脊髓微環(huán)路。通過對條件性標(biāo)記5-HT纖維結(jié)合組織免疫染色，作者比較了小鼠DHSC中5-HT纖維與興奮性（tlx3）或抑制性神經(jīng)元（Pax2）標(biāo)記物的位置。結(jié)果顯示，在雄性和雌性中，5-HT纖維與Pax2的接觸比tlx3更密切，這表明5-HT纖維與脊髓局部抑制性中間神經(jīng)元之間存在聯(lián)系。為了證實(shí)這一假設(shè)，作者使用GABA能神經(jīng)元熒光標(biāo)記的小鼠并進(jìn)行TPH2免疫染色，在GABA能中間神經(jīng)元的胞體和纖維上發(fā)現(xiàn)了5-HT+末梢。另外，作者利用病毒介導(dǎo)的條件表達(dá)方式，對RMg中的5-HT神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記，并在DHSC的深層中發(fā)現(xiàn)了突觸末端。最后作者利用雜交的轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)合病毒介導(dǎo)的條件表達(dá)的方式，觀察到DHSC中RMg 5-HT的神經(jīng)投射與GABA能神經(jīng)元的胞體和纖維上形成的突觸連接。
 

 

為了確定光遺傳刺激是否激活DHSC中的抑制性中間神經(jīng)元，作者在光遺傳刺激進(jìn)行了cFos/ Pax2免疫染色。結(jié)果顯示，在DHSC的淺層和深層，同時含有Pax2(+)的c-Fos(+)神經(jīng)元，表明光遺傳激活5HT纖維激活了脊髓抑制性中間神經(jīng)元。最后，為了證實(shí)這種鎮(zhèn)痛作用是由于RMg 5-HT神經(jīng)元和DHSC中抑制性中間神經(jīng)元的微環(huán)路所介導(dǎo)，作者評估了動物在鞘內(nèi)注射拮抗劑阻斷GABAA和甘氨酸受體后，光遺傳刺激5-HT纖維時的機(jī)械和熱刺激敏感性。注射拮抗劑抑制了光遺傳刺激對小鼠的鎮(zhèn)痛作用。為了證實(shí)這種阻斷改變了DHSC的傷害性信息傳遞，作者對WDR神經(jīng)元進(jìn)行了體內(nèi)電生理記錄，觀察到阻斷GABA/甘氨酸受體會抑制WDR神經(jīng)元反應(yīng)性的降低。這些結(jié)果表明，來源于RMg的5-HT纖維通過作用于脊髓中的抑制性中間神經(jīng)元從而抑制脊髓傷害性信息傳遞。
 

 

5. 阻斷脊髓KCC2將RMg 5-HT的下行抑制轉(zhuǎn)換成興奮
在神經(jīng)病理性疼痛模型中，氯平衡失調(diào)導(dǎo)致的抑制解除似乎是神經(jīng)元超興奮和疼痛超敏反應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制。因此，作者研究了是否可以通過改變DHSC中的氯平衡來逆轉(zhuǎn)RMg 5-HT神經(jīng)投射的光遺傳激活效應(yīng)。作者采用了兩種不同的氯轉(zhuǎn)運(yùn)體阻斷劑，非選擇性的抑制劑速尿和選擇性的KCl轉(zhuǎn)運(yùn)體KCC2抑制劑VU043271。在這兩種情況下，光遺傳刺激5-HT纖維均能誘導(dǎo)動物的疼痛敏感性顯著增加。體內(nèi)電生理記錄顯示，VU043271能夠引起5-HT神經(jīng)元光遺傳激活時WDR神經(jīng)元反應(yīng)性的切換。在給予VU043271后，當(dāng)RMg 5-HT神經(jīng)投射受到光遺傳刺激時，WDR神經(jīng)元對外周刺激的反應(yīng)增加。這些結(jié)果表明，改變氯平衡可以將血清素能抑制轉(zhuǎn)化為興奮。
 

 

6. 神經(jīng)損傷引起脊髓KCC2功能低下導(dǎo)致RMg 5-HT的下行抑制轉(zhuǎn)換成興奮
然后，作者使用神經(jīng)病理性疼痛（SNI）小鼠模型研究了5-HT下行通路在病理背景下的作用。在SNI手術(shù)后兩周，小鼠表現(xiàn)出強(qiáng)烈的機(jī)械痛和熱痛超敏反應(yīng)。形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果確定了SNI小鼠的5-HT下行神經(jīng)投射結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生變化，其密度與突觸連接與Naïve小鼠相當(dāng)。在SNI小鼠中，當(dāng)作者用光遺傳刺激激活脊髓中的RMg 5-HT下行纖維時，小鼠機(jī)械痛和熱痛超敏反應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。
 

 

在體電生理記錄表明，這些機(jī)械痛和熱痛過敏反應(yīng)增強(qiáng)與DHSC神經(jīng)元的反應(yīng)性增加相關(guān)，在脊髓5-HT纖維末梢的光遺傳激活過程中，WDR神經(jīng)元對外周刺激中c -纖維傳入的反應(yīng)顯著增加。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示，脊髓神經(jīng)元氯離子失衡可能會通過將RMg 5-HT纖維的下行抑制作用轉(zhuǎn)換為下行易化來改變對疼痛的控制。
 

 

為了驗(yàn)證這一可能性，作者使用CLP290從藥理學(xué)上增強(qiáng)SNI小鼠的KCC2氯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。作者觀察到CLP290能夠顯著誘導(dǎo)了DHSC神經(jīng)元細(xì)胞膜上的KCC2水平增加。然后，作者評估了CLP290處理后的SNI小鼠在光遺傳刺激時的疼痛行為，5-HT纖維的光遺傳刺激顯著緩解了SNI小鼠的機(jī)械痛和熱痛過敏。利用在體電生理記錄，作者還發(fā)現(xiàn)，在CLP290處理后，小鼠的WDR神經(jīng)元在RMg 5-HT纖維的光刺激過程中對外周刺激的反應(yīng)性降低。這些結(jié)果表明，KCC2介導(dǎo)的氯平衡能夠控制RMg 5-HT的下行效應(yīng)：正常的氯平衡能夠有效的維持RMg 5-HT下行投射的抑制作用，而神經(jīng)損傷后KCC2功能低下，引起氯平衡失調(diào)，導(dǎo)致RMg 5-HT的下行抑制作用轉(zhuǎn)為下行易化。
 

 

7. 挽救KCC2功能恢復(fù)SSRI介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛
上述機(jī)制可能解釋了為什么SSRIs不能緩解慢性疼痛患者的疼痛。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者將SSRI治療與KCC2增強(qiáng)子結(jié)合。作者觀察到，在SNI小鼠中證實(shí)單獨(dú)注射SSRI氟西汀可引起輕微的機(jī)械痛和熱痛過敏，CLP290能夠輕微但顯著地降低了機(jī)械痛和熱痛過敏。相比之下，氟西汀和CLP290聯(lián)合使用可強(qiáng)烈緩解機(jī)械痛和熱痛過敏，這種鎮(zhèn)痛效果在單次注射后24小時仍然存在。最后，作者利用條件性位置偏好實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這種鎮(zhèn)痛作用，在測試時，SNI小鼠明顯傾向于停留在訓(xùn)練時給予氟西汀+CLP290的箱體中，表明氟西汀聯(lián)合CLP290顯著改善了SNI小鼠的疼痛狀態(tài)合。
 

 

總結(jié)

該研究結(jié)果表明，RMg中下行的5-HT神經(jīng)纖維通過與DHSC中的抑制中間神經(jīng)元形成突觸連接，產(chǎn)生了對機(jī)械和熱刺激的門控作用。此外，KCC2下調(diào)是5-HT下行纖維影響痛覺傳遞信號變化的基礎(chǔ)，在病理狀態(tài)下由疼痛抑制向疼痛易化轉(zhuǎn)變。這些結(jié)果表明，下行興奮和抑制之間的平衡取決于脊髓水平的局部改變，這與先前的看法相反。特別是，相同的5-HT環(huán)路可以是興奮和/或抑制的，取決于目標(biāo)區(qū)域的興奮性。

研究方法亮點(diǎn)

這項(xiàng)工作闡述了內(nèi)源性血清素源性疼痛調(diào)節(jié)不穩(wěn)定性的作用機(jī)制。研究用到了腦立體定位注射、光遺傳學(xué)、在體電生理記錄、行為學(xué)評估以及免疫組化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。瑞沃德深耕生命科學(xué)研究領(lǐng)域20年，一直致力于為客戶提供可信賴的解決方案和服務(wù)，在該研究中，瑞沃德提供了自主研發(fā)的腦立體定位注射系統(tǒng)，確保相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作能夠精準(zhǔn)完成。此外，瑞沃德還可提供該研究所涉及的光遺傳學(xué)、在體電生理記錄、行為學(xué)評估以及免疫組化等實(shí)驗(yàn)的完整解決方案。截至目前，瑞沃德產(chǎn)品及服務(wù)覆蓋海內(nèi)外 100 多個國家和地區(qū)，客戶涵蓋全 球700+醫(yī)院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全 球科研人員發(fā)表SCI文章14500+，獲得行業(yè)廣泛認(rèn)可。
 

原文鏈接：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abo0689