腦小血管病（Small Vessel Disease, SVD）在醫(yī)學(xué)界常常被稱為“小卒中”，盡管癥狀小，但危害大，因此近年來逐漸受到重視。腦小血管病是血管性癡呆的主要原因，與臨床上四分之一的卒中有關(guān)，還會導(dǎo)致運(yùn)動障礙和情感障礙。然而，該疾病的臨床表現(xiàn)往往是隱蔽的，患病個體和臨床醫(yī)生都沒有充分認(rèn)識到。

通常認(rèn)為，腦小血管病的風(fēng)險隨著年齡的增長而增加，并且與高血壓、糖尿病和高膽固醇血癥相關(guān)。盡管高血壓一直被認(rèn)為是該疾病的危險因素，但大約30%的散發(fā)患者并沒有高血壓病史，而且這也無法解釋該病的斑塊性質(zhì)以及與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙之間的關(guān)聯(lián)。

 

為此，來自愛丁堡大學(xué)的科研人員構(gòu)建了一種在維持正常血壓的情況下卻患有腦小血管病的基因編輯大鼠模型，證明了磷脂翻轉(zhuǎn)酶ATP11B缺失導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，繼而引起腦小血管病，即使在沒有高血壓的情況下也會發(fā)生。該研究于近日以Loss of the heterogeneous expression of flippase ATP11B leads to cerebral small vessel disease in a normotensive rat model為題發(fā)表在Acta Neuropathologica雜志上，有望為腦小血管病的治療提供新的策略。

研究材料
本項(xiàng)研究主要使用了由賽業(yè)生物構(gòu)建的血壓正常的ATP11B缺失的Atp11b KO大鼠模型。

技術(shù)方法
本項(xiàng)研究主要采用了免疫熒光、電鏡觀察和磁共振成像等病理學(xué)和影像學(xué)研究技術(shù)，以及步態(tài)分析、新物體識別和迷宮實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)研究方法。

技術(shù)路線

01 評估磷脂翻轉(zhuǎn)酶ATP11B在多種腦細(xì)胞中的表達(dá)

02 構(gòu)建Atp11b KO大鼠，系統(tǒng)敲除大鼠的Atp11b基因

03 評估Atp11b KO大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞是否存在功能障礙

04 通過MRI觀察Atp11b KO大鼠腦部的影像學(xué)變化

05 通過多項(xiàng)行為學(xué)測試分析Atp11b KO大鼠的行為特征變化

研究結(jié)果
1.構(gòu)建ATP11B缺失的腦小血管病大鼠模型
腦小血管病在影像學(xué)上表現(xiàn)為腔隙綜合征、腦白質(zhì)病變以及微出血等多種腦組織損傷。白質(zhì)變化與血管疾病之間的關(guān)聯(lián)可能在于血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞（EC）。研究人員之前在自發(fā)性高血壓大鼠模型中的相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明磷脂翻轉(zhuǎn)酶ATP11B的缺失可能與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙之間存在關(guān)聯(lián)。

在這項(xiàng)研究中，研究人員從ATP11B著手開展深入分析，通過檢測發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元均表達(dá)ATP11B，但均以異質(zhì)性方式表達(dá)。膠體金免疫電鏡的觀察結(jié)果也證實(shí)，ATP11B蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)明顯異質(zhì)性，在同一血管的同一橫切面中的表達(dá)也呈現(xiàn)異質(zhì)性。

為了研究在血壓正常的情況該疾病的病理學(xué)，作者與賽業(yè)生物合作。賽業(yè)生物利用CRISPR-Cas9技術(shù)系統(tǒng)敲除了Atp11b基因中5號外顯子至8號外顯子之間的序列，導(dǎo)致ATP11B蛋白無表達(dá)，成功構(gòu)建ATP11B缺失的Atp11b KO基因編輯大鼠模型（圖1）。與野生型對照大鼠相比，Atp11b KO大鼠無明顯的健康問題，并且血壓正常。接下來，作者進(jìn)一步研究了在正常血壓且ATP11B缺失的情況下，幼年大鼠和成年大鼠是否仍會出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。
 

圖1 Atp11b KO基因編輯大鼠的構(gòu)建策略及不同對照組的血壓數(shù)據(jù)

2.Atp11b KO大鼠表現(xiàn)出與SVD相似的變化
內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可通過幾種分子特征來定義，包括內(nèi)皮型一氧化氮合成酶eNOS的喪失、緊密接連跨膜蛋白CLDN5的減少以及內(nèi)皮激活標(biāo)志物ICAM-1的上調(diào)。研究人員發(fā)現(xiàn)，Atp11b KO幼年大鼠腦部的CLDN5⁺血管顯著減少，內(nèi)皮細(xì)胞增殖增加。成年大鼠的CLDN5⁺血管的減少程度和ICAM-1的表達(dá)上調(diào)幅度更大。

同時，視網(wǎng)膜成像分析表明，幼年KO大鼠的視網(wǎng)膜動脈直徑減少，成年大鼠的動脈直徑和曲折度減少，但神經(jīng)叢血管分支增加，這些與腦小血管病的特征相關(guān)。以上結(jié)果表明，KO大鼠的異常與高血壓無關(guān)。以上數(shù)據(jù)表明，盡管不存在高血壓，但Atp11b KO大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞仍表現(xiàn)出功能障礙的分子特征。

接下來，研究人員分析了ATP11B缺失是否影響了白質(zhì)變化。通過分析KO大鼠血管周圍10µm環(huán)內(nèi)髓鞘碎片與空泡的百分比，作者發(fā)現(xiàn)髓鞘組織的破壞增加，但不同血管之間存在差異，這可能取決于內(nèi)皮細(xì)胞中ATP11B表達(dá)的異質(zhì)性。這些結(jié)果支持了之前的假設(shè)：內(nèi)皮細(xì)胞的變化驅(qū)動了血管周圍的白質(zhì)變化。后續(xù)分析證實(shí)，Atp11b KO大鼠小血管周圍的白質(zhì)損傷呈斑片狀，與其內(nèi)皮功能障礙有關(guān)。

之后，作者繼續(xù)采用磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）評估了大鼠的腦部特征，這也是人類腦小血管病的診斷方式。與野生型對照相比，所有KO大鼠在晚年都有腦室擴(kuò)大。正如預(yù)期的那樣，腦室擴(kuò)大與組織體積的減少有關(guān)，表明存在神經(jīng)退行性病變，并且與腦小血管病中的腦萎縮和腦室擴(kuò)大一致（圖2）。此外，KO大鼠也存在微出血的MR證據(jù)，與人類患者一致。
 

圖2 Atp11b KO大鼠表現(xiàn)出與SVD相似的MR

那么，這些影像和病理變化如何影響大鼠的行為？作者通過進(jìn)一步的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與腦小血管病的患者相似，KO大鼠的步態(tài)和認(rèn)知都存在問題，隨著年齡的增長記憶力也較差。此外，在高架十字迷宮中，KO大鼠的總體移動距離明顯更短，也反映出KO大鼠存在移動和認(rèn)知上的問題。

研究結(jié)論
這項(xiàng)研究表明，Atp11b KO大鼠在沒有高血壓的情況下出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、腦白質(zhì)病變和影像學(xué)變化，以及與腦小血管病患者相似的行為特征。這些結(jié)果推翻了散發(fā)性腦小血管病依賴高血壓的傳統(tǒng)觀點(diǎn)，使人們的注意力重新集中在內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙上，這有望為腦小血管病及癡呆癥的治療帶來新策略。

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品系編號：

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產(chǎn)品編號：

S-KO-14829

應(yīng)用方向：

❖ 骨骼系統(tǒng)

❖ 視力/眼睛；四肢/尾巴

❖ 內(nèi)皮細(xì)胞功能；細(xì)胞定位等

打靶方案：

原文檢索：
Quick, S., Procter, T.V., Moss, J. et al. Loss of the heterogeneous expression of flippase ATP11B leads to cerebral small vessel disease in a normotensive rat model. Acta Neuropathol 144, 283–303 (2022).