慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）是一種惰性的血液系統(tǒng)癌癥，通常進(jìn)展緩慢。大多數(shù)患者在早期并沒有癥狀，僅僅是因?yàn)榘准?xì)胞計(jì)數(shù)增加才被診斷出。CLL的特點(diǎn)是成熟的CD5⁺B細(xì)胞在血液和淋巴器官中積累。盡管多種藥物的治療效果良好，但侵襲性病例會(huì)產(chǎn)生耐藥性。

CLL細(xì)胞高度依賴于腫瘤微環(huán)境。歸巢到外周淋巴器官和骨髓對(duì)于CLL細(xì)胞至關(guān)重要，可使其進(jìn)入腫瘤保護(hù)小生境，并接收促生存信號(hào)。NEDD9是淋巴細(xì)胞遷移的關(guān)鍵調(diào)控因子，大量研究表明，它能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散。不過(guò)，NEDD9在淋巴細(xì)胞白血病中的作用還不大清楚。

近日，德國(guó)科隆大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)利用小鼠模型來(lái)破譯NEDD9在CLL發(fā)病機(jī)制中的功能相關(guān)性。他們發(fā)現(xiàn)NEDD9是白血病細(xì)胞遷移和疾病進(jìn)展所必需的。這項(xiàng)研究成果于2022年5月發(fā)表在《Leukemia》雜志上。
 

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了慢性淋巴細(xì)胞白血病經(jīng)典的Eµ-TCL1小鼠模型，并委托賽業(yè)生物構(gòu)建了Nedd9條件性敲除小鼠模型。研究者還采集了CLL患者和健康對(duì)照的原代CLL細(xì)胞及淋巴結(jié)活檢樣本，主要開展了細(xì)胞歸巢和遷移分析，以及細(xì)胞粘附分析。

技術(shù)路線
01研究Nedd9敲除對(duì)CLL疾病進(jìn)展的影響

02確定Nedd9缺失對(duì)CLL細(xì)胞歸巢的影響

03分析CLL患者的NEDD9表達(dá)水平，確定其臨床意義

04研究NEDD9相關(guān)通路的阻斷是否可減少CLL細(xì)胞遷移

研究結(jié)果
1.Nedd9的缺失延遲了CLL的進(jìn)展
Eµ-TCL1小鼠模型被廣泛用于慢性淋巴細(xì)胞白血病的研究。基于Eµ-TCL1模型，研究人員構(gòu)建了TCL1（TCL1^tg/wtNedd9^wt/wt）和TCL1-N（TCL1^tg/wtNedd9^−/−）小鼠，以分析組成型的Nedd9敲除對(duì)CLL發(fā)病機(jī)制的影響。有趣的是，與TCL1組相比，TCL1-N組的總生存期大大延長(zhǎng)。這種生存差異反映了Nedd9的缺失顯著延遲了CLL發(fā)作。

同時(shí)，免疫組化染色結(jié)果顯示，CD45R⁺B細(xì)胞嚴(yán)重浸潤(rùn)TCL1小鼠的脾臟和骨髓，但TCL1-N小鼠中的浸潤(rùn)卻很有限。由此可見，TCL1-N小鼠骨髓和脾臟中的CLL浸潤(rùn)與TCL1小鼠相比明顯減少。這些結(jié)果表明，Nedd9的缺失顯著延遲了CLL的發(fā)作和進(jìn)展，特別是破壞了CLL細(xì)胞在淋巴器官中的浸潤(rùn)，使小鼠獲得了明顯的生存優(yōu)勢(shì)。

為了研究B細(xì)胞特異性的Nedd9缺失是否影響CLL發(fā)病機(jī)制，研究人員委托賽業(yè)生物構(gòu)建了一個(gè)Nedd9條件性敲除小鼠模型，其中Nedd9僅在B細(xì)胞譜系中缺失（圖1）。他們將該基因型小鼠與TCL1小鼠雜交，生成了B細(xì)胞缺失Nedd9的TC-N（TCL1^tg/wtCD19Cre^tg/wtNedd9^flfl）小鼠和作為對(duì)照的TC（TCL1^tg/wtCD19Cre^wt/wtNedd9^flfl）小鼠。與TC小鼠相比，TC-N小鼠的CLL發(fā)病顯著延遲，CLL細(xì)胞向骨髓和脾臟的浸潤(rùn)也減少。第二個(gè)獨(dú)立的小鼠模型再次證實(shí)了Nedd9在CLL發(fā)病機(jī)制中的作用，并強(qiáng)調(diào)了B細(xì)胞內(nèi)在的Nedd9活性是這種影響的主要貢獻(xiàn)者。
 

圖1 B細(xì)胞特異性的Nedd9缺失可降低小鼠的CLL疾病負(fù)荷

2.Nedd9缺失破壞CLL細(xì)胞歸巢至淋巴器官
接下來(lái)，研究人員深入探索了其中的機(jī)制。多個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并未顯示NEDD9對(duì)B細(xì)胞增殖、凋亡或BCR信號(hào)通路有重大影響。那么，Nedd9缺失是否會(huì)改變CLL細(xì)胞歸巢？他們對(duì)TCL1和TCL1-N CLL細(xì)胞開展了短期歸巢分析。

他們將CFSE標(biāo)記的CLL細(xì)胞注射到受體小鼠內(nèi)，3小時(shí)后收集器官進(jìn)行浸潤(rùn)分析。與TCL1細(xì)胞相比，TCL1-N CLL細(xì)胞較少浸潤(rùn)到受體的脾臟中，不過(guò)骨髓浸潤(rùn)沒有差異。免疫缺陷型NSG小鼠的結(jié)果也類似。這些數(shù)據(jù)表明，Nedd9促使CLL細(xì)胞有效歸巢至淋巴組織，這是導(dǎo)致CLL進(jìn)展的重要機(jī)制。

細(xì)胞粘附和遷移是淋巴細(xì)胞歸巢中的基本過(guò)程，于是他們開展了細(xì)胞粘附分析。TCL1-N CLL細(xì)胞完全無(wú)法粘附到纖連蛋白（CLL歸巢中的主要粘附分子），對(duì)BMSC的粘附也顯著受損。此外，Nedd9的缺失導(dǎo)致CLL細(xì)胞遷移明顯減少。因此，研究人員認(rèn)為，NEDD9的缺失主要是通過(guò)破壞CLL細(xì)胞粘附和遷移而影響其歸巢。

3.NEDD9的臨床意義
研究人員從CLL患者和健康對(duì)照的外周血中分離出B細(xì)胞，并檢測(cè)了磷酸化NEDD9和總NEDD9的表達(dá)水平。分析結(jié)果表明，NEDD9在CLL細(xì)胞中持續(xù)激活，對(duì)細(xì)胞刺激（如BCR激活）的反應(yīng)喪失（圖2）。基因關(guān)聯(lián)分析表明，NEDD9 mRNA在外周血CLL細(xì)胞中的表達(dá)與粘附和遷移信號(hào)通路高度相關(guān)，而且人類CLL淋巴結(jié)經(jīng)常高水平表達(dá)NEDD9，部分患者的NEDD9表達(dá)在CLL增殖中心富集。同時(shí)，NEDD9水平還與白細(xì)胞計(jì)數(shù)之間存在強(qiáng)的正相關(guān)，而白細(xì)胞計(jì)數(shù)正是CLL侵襲性的標(biāo)志。這些結(jié)果都提示了NEDD9在CLL發(fā)病機(jī)制中的功能性作用。
 

圖2 NEDD9表達(dá)與CLL細(xì)胞的粘附和遷移特征相關(guān)

他們進(jìn)一步推測(cè)，在Nedd9敲除細(xì)胞中，CXCL12的趨化性受損是細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)缺陷的結(jié)果。目前已知NEDD9能夠共激活A(yù)URKA/HDAC6信號(hào)軸，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架變化。于是他們分析了AURKA抑制劑和HDAC抑制劑是否能夠阻斷CLL細(xì)胞遷移。他們發(fā)現(xiàn)，兩種抑制劑都能顯著降低CLL細(xì)胞的遷移和趨化性。這些數(shù)據(jù)表明，靶向NEDD9相關(guān)通路（如AURKA-HDAC6-CTTN信號(hào)通路）是一種有潛力的策略，可預(yù)防CLL歸巢，從而限制疾病進(jìn)展。

研究結(jié)論

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，說(shuō)明NEDD9在CLL發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮功能性作用。這些結(jié)果可以加深人們對(duì)CLL歸巢機(jī)制的了解，也有望為CLL患者設(shè)計(jì)其他的治療方法，以阻止CLL細(xì)胞遷移和疾病進(jìn)展。

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建
賽業(yè)生物『紅鼠資源庫(kù)』可提供同類型C57BL/6J-Nedd9^em1(flox)Cya條件性基因敲除小鼠，有助于科學(xué)研究。
 

Nedd9條件性基因敲除小鼠

品系名稱：C57BL/6J-Acaca^em1Cya
品系編號(hào)：C57BL/6J-Nedd9^em1(flox)Cya
產(chǎn)品編號(hào)：S-CKO-03919

應(yīng)用方向：
❖ 免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)
❖ 細(xì)胞分化、信號(hào)傳導(dǎo)
❖ 行為/神經(jīng)

打靶方案：

原文檢索：
Rusyn, L., Reinartz, S., Nikiforov, A. et al. The scaffold protein NEDD9 is necessary for leukemia-cell migration and disease progression in a mouse model of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 36, 1794–1805 (2022). https://doi.org/10.1038/s41375-022-01586-1