Rptor基因是雷帕霉素蛋白激酶靶標（protein kinase target of rapamycin, TOR）的主要參與編碼基因之一，編碼雷帕霉素靶點復合體1（mTORC1）的其中一個亞基，是mTOR信號通路的組成部分，參與細胞生長與能量代謝的過程。mTOR信號通路在機體發(fā)育和衰老中發(fā)揮關鍵作用，并與癌癥、心血管疾病、肥胖和糖尿病等疾病有關。與該基因相關的疾病主要有結節(jié)性硬化癥、血管平滑肌脂肪瘤、神經性疾病和脂肪代謝疾病等。

賽業(yè)生物《每周一鼠》，每周五更新，為大家講解一個小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是Rptor基因敲除小鼠。

Rptor基因簡介
Rptor基因又稱Rap、Raptor，位于小鼠的11號染色體上，該基因編碼小鼠mTORC1的一個亞基，該亞基是mTOR信號通路的一個組成部分，調節(jié)細胞生長對營養(yǎng)和能量水平的響應。TOR是一個高度保守的細胞生長和代謝的中央控制器，在機體發(fā)育和衰老中發(fā)揮關鍵作用，并與癌癥、心血管疾病、肥胖和糖尿病等疾病有關^[1]。Rptor基因編碼的蛋白可能調控mTORC1復合物的組裝、定位和底物結合。mTORC1控制著很多決定細胞生長的細胞過程，包括蛋白質合成、核糖體生物發(fā)生、營養(yǎng)物質運輸和自噬。Rptor基因的純合敲除小鼠表現出胚胎毒性。在成年小鼠的腎上腺（RPKM 14.6）、胸腺（RPKM 13.0）等28個組織中普遍表達。該基因的突變與結節(jié)性硬化癥，結節(jié)性硬化癥1，Bardet-Biedl綜合征，Cowden綜合征等疾病有關。其相關通路有長壽調節(jié)途徑和MAPK-Erk通路。
 

                                                   圖1 Rptor基因相關信息

來源：RDDC罕見病數據中心

（https://rddc.tsinghua-gd.org/details/gene?gene=md1EQ2）

 

Rptor基因敲除小鼠模型的應用

1.脂肪
Rptor基因編碼的雷帕霉素靶點復合體1（mTORC1）的亞基，參與調控mTORC1復合物的組裝、定位和底物結合。mTORC1在脂肪代謝組織中起著關鍵作用，參與調節(jié)脂肪細胞脂質儲存^[2]。脂肪組織過多或缺乏會導致嚴重的代謝性疾病，如2型糖尿病、心血管疾病和癌癥。為了研究mTORC1在體內脂肪組織代謝的作用，研究人員建立了Rptor基因敲除小鼠模型。由于小鼠中Rptor的全身敲除是胚胎致死的^[3]，因此使用Cre/loxP系統(tǒng)，通過ES打靶技術條件性敲除第6外顯子，建立基因敲除小鼠模型，經與Cre工具鼠交配后使Rptor基因只在脂肪組織中被敲除。
 

圖2 Rptor基因的條件性敲除方案策略^[4]

后續(xù)實驗中使用未與Cre鼠交配的經基因打靶修飾的同窩小鼠（Rptor^fl/fl）作為對照，驗證Rptor基因在小鼠脂肪組織代謝中的作用。經普通飼料和高脂飼料分別喂養(yǎng)13周后，對照組小鼠與實驗組小鼠的體重出現明顯差異，如圖3所示。
 

圖3 喂養(yǎng)不同飼料的小鼠體重變化與喂養(yǎng)HFD的13周后小鼠對比圖^[4]

 

取出小鼠的附睪、腹股溝與肩胛間白色脂肪進行稱重與拍照，并對附睪脂肪進行H&E染色，可以看到Rptor基因敲除鼠（Rptor^ad-/-）的脂肪組織量明顯減少，并且喂食高脂飼料（High fat diet，HFD）的實驗組附睪組織脂肪細胞大小與對照組相比明顯變小，說明脂肪組織的減少不僅是脂肪細胞減少造成的，也有脂肪細胞的體積縮�。ㄈ鐖D4）。
 

 高脂飲食13周后的小鼠主要白色脂肪組織與附睪的H&E染色結果^[4]

以上結果表明，Rptor基因在控制脂肪代謝和全身能量穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，在脂肪組織中特異性敲除Rptor基因可使小鼠變得瘦弱，并對飲食誘導的肥胖具有抗性。這顯示Rptor編碼的mTORC1是抗肥胖和抗糖尿病藥物的潛在靶點。（賽業(yè)可提供同類型Rptor條件性敲除模型，產品編號：S-CKO-15978）

2.骨骼肌
骨骼肌質量和力量的喪失在許多病理中都是重要的參考指標，如與年齡相關的骨骼肌減少癥或癌癥。有研究表明，Akt-mTORC1通路對刺激成人肌肉質量和功能至關重要，Rptor的缺失可以減少Akt激活后的肌肉肥厚，并完全阻止肌肉力量的增加。為探索mTORC1在肌肉肥厚中的作用，研究人員構建了Rptor基因條件性敲除小鼠模型，通過Cre/loxP系統(tǒng)在相應組織細胞中敲除Rptor基因，在mTORC1的蛋白功能缺失模型中誘導肌肉肥厚。

將Akt誘導模型（LSL-myr-AKT-ER，條件性誘導表達）與Raptor floxed小鼠交配，從而獲得了Akt/Raptor floxed模型。單次注射腺相關病毒（AAV）會導致成年小鼠腓腸肌和脛骨前肌中的Cre蛋白以非常高的效率感染。Cre介導lox位點重組后，Rptor基因被有效刪除，且myr-AKT-ER在細胞質中實現表達；一個月后，當Raptor被有效刪除時，再次注射他莫昔芬誘導myr-AKT-ER進入細胞核從而激活Akt。
 

 Rptor基因的條件性敲除流程圖^[5]

研究人員選取野生型作為對照，實驗組分別為Akt信號因子誘導的野生型、Rptor敲除小鼠與Akt誘導的Rptor敲除小鼠。通過對小鼠肌肉組織進行H&E染色，發(fā)現經Akt激活后肌肉細胞均有肥大現象，但與野生型小鼠的肥大不同，Akt Rptor k.o.小鼠的肌肉組織明顯受損，這可以從細胞核、炎癥細胞的浸潤和壞死纖維上得到證明（如圖6）。
 

后續(xù)通過線粒體組織學染色探索Rptor對肌肉組織中線粒體活性的影響，可以看到Akt Rptor k.o.小鼠的線粒體與野生型相比有明顯的差異，出現了集中局部集群，提示線粒體功能障礙。
 

經Akt信號因子誘導的野生型與Rptor敲除小鼠的線粒體SDH染色^[5]
 

綜上所述，這些結果表明Rptor是akt依賴性肌肉生長的關鍵基因，該基因對線粒體蛋白組的調節(jié)不可或缺，線粒體生物發(fā)生是誘導或維持功能性肌肉生長的關鍵。由此可以看出Rptor對肌肉力量的增加至關重要，Rptor基因的缺失會導致肌肉合成代謝的失調，從而造成各種肌肉相關疾病。

總結
與Rptor基因相關的疾病有多種，包括結節(jié)性硬化癥、血管平滑肌脂肪瘤、肌肉肥大相關疾病、脂肪代謝疾病和神經性疾病等等，這些疾病大多數是多種基因共同參與調控的。Rptor基因主要編碼mTORC1的一個亞基，參與mTOR信號通路的調控。TOR與細胞生長、能量代謝密不可分，并且mTOR信號通路在機體發(fā)育和衰老中發(fā)揮著關鍵作用。Rptor基因敲除小鼠模型的構建可以用于mTOR信號傳導的機理研究，肌肉組織中蛋白質解偶聯(lián)產生的熱量相關研究和肌肉及脂肪組織代謝相關研究等等，具有廣泛的科研意義。

賽業(yè)小鼠模型構建
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Rptor基因敲除小鼠

小鼠福利，限定發(fā)放中~

品系名稱：C57BL/6J-Rptor^em1(flox)Cya

品系編號：CKOCMP-74370-Rptor-B6J-VA

產品編號：S-CKO-15978

應用方向：

❖ mTOR信號傳導

❖ 肌肉組織中蛋白質解偶聯(lián)產生的熱量相關研究

❖ 胃食管交界處腺癌等腫瘤研究

打靶方案：

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參考文獻：

[1]Guertin DA, Sabatini DM. Defining the role of mTOR in cancer. Cancer Cell. 2007 Jul;12(1):9-22. doi: 10.1016/j.ccr.2007.05.008. PMID: 17613433.

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[3]Guertin DA, Stevens DM, Thoreen CC, Burds AA, Kalaany NY, Moffat J, Brown M, Fitzgerald KJ, Sabatini DM. Ablation in mice of the mTORC components rptor, rictor, or mLST8 reveals that mTORC2 is required for signaling to Akt-FOXO and PKCalpha, but not S6K1. Dev Cell. 2006 Dec;11(6):859-71. doi: 10.1016/j.devcel.2006.10.007. PMID: 17141160.

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