正畸牙齒移動過程中的生物學(xué)基礎(chǔ)是牙槽骨重塑。牙槽骨重塑是一個連續(xù)的、復(fù)雜的、協(xié)調(diào)的生物學(xué)過程，涉及成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收。人牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）的機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化是正畸中張力側(cè)牙槽骨重塑的重要組成部分。

之前的研究表明，在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的 PDLSCs 成骨分化過程中，活性氧（ROS）水平升高，并誘導(dǎo)核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）及其下游分子如血紅素加氧酶1（HO-1）和醌NADH脫氫酶1（NQO1）的表達(dá)。

Nrf2作為主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)包括HO1和NQO1在內(nèi)的抗氧化成分的表達(dá)和活性，對內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)和細(xì)胞防御具有關(guān)鍵作用。許多信號通路對于調(diào)節(jié) Nrf2 活性至關(guān)重要，例如蛋白激酶 C（PKC）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和 p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）。

山東大學(xué)口腔醫(yī)院口腔正畸科、山東省口腔組織再生重點實驗室和山東省口腔生物材料與組織再生工程實驗室的一項研究旨在通過基于串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽 (TMT) 的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 分析探索 Nrf2 潛在的循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激成骨分化的機(jī)制，將 Nrf2 激活劑叔丁基對苯二酚（t-BHQ）應(yīng)用于正畸大鼠，通過免疫組織化學(xué)（IHC）染色檢測成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平，以證實 Nrf2 可能是改善正畸中牙槽骨重塑的有希望的治療靶點。
 

首先，實驗通過LC-MS/MS 研究了 Nrf2 在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的 PDLSCs 成骨分化中的潛在分子機(jī)制，將PDLSCs在10% 和0.5 hz循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下處理0和12 h。結(jié)果顯示，與對照相比，162個蛋白出現(xiàn)差異表達(dá)，其中下調(diào)76個，上調(diào)86個。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與了生物過程類別中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸和免疫系統(tǒng)過程。在差異表達(dá)蛋白的KEGG通路富集分析中，PI3K/Akt 信號通路引起了研究人員的注意，因為它在 Nrf2 的激活和易位中起著至關(guān)重要的作用，因此選擇PI3K/Akt信號通路在后續(xù)研究中進(jìn)一步研究。

接下來，為了確認(rèn)在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化過程中 PI3K/Akt 信號通路參與 PDLSC 中 Nrf2的激活，基于 KEGG 通路分析，在研究中應(yīng)用了 LY294002。循環(huán)機(jī)械應(yīng)力增加了 Akt的磷酸化（p-Akt），而 PI3K 抑制劑 LY294002 抑制了 p-Akt 的水平（圖1 A）。LY294002下調(diào)Nrf2的mRNA、細(xì)胞質(zhì)和核蛋白表達(dá)水平（圖1 B、C）。

然后測量了PDLSCs 中有或沒有 LY294002 的情況下，循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化能力。數(shù)據(jù)顯示，LY294002抑制成骨相關(guān)標(biāo)志物（COL1、RUNX2和OPN）的mRNA和蛋白表達(dá)水平（圖1 D、E）。并且LY294002使HO1 的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。上述結(jié)果表明，循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的 PDLSCs 成骨細(xì)胞分化中，PI3K/Akt 通路與調(diào)節(jié)Nrf2 表達(dá)有關(guān)。
 

圖1 循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激下的PDLSCs成骨分化過程中，PI3K/Akt信號通路參與Nrf2激活
 

（A）基于蛋白質(zhì)印跡實驗，PI3K抑制劑LY294002在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下抑制p-Akt水平。（B） LY294002在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下下調(diào)PDLSCs中Nrf2 mRNA水平。（C） LY294002降低了循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下PDLSCs中Nrf2的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和核蛋白表達(dá)水平。 （D） LY294002抑制了循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下PDLSCs中成骨相對標(biāo)記物（COL1、RUNX2、OPN）和HO1的mRNA水平。（E）LY294002抑制了循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下PDLSCs中成骨相對標(biāo)記物（COL1、RUNX2、OPN）和HO1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。（F）Co-IP實驗表明，PDLSCs中Akt和Nrf2之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分別與抗Akt抗體和抗Nrf2抗體進(jìn)行免疫沉淀以富集蛋白質(zhì)復(fù)合物。

為了進(jìn)一步證實在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力過程中，PI3K/Akt 信號通路在 PDLSCs 中 Nrf2 激活的參與，在隨后的研究中使用了 STRING 數(shù)據(jù)庫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Akt 和 Nrf2 之間潛在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可能與該過程有關(guān)。用抗 Nrf2 抗體進(jìn)行免疫沉淀實驗以富集含有 Nrf2 的蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后用抗 Akt 抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。結(jié)果表明，Akt存在于含有Nrf2的復(fù)合物中（圖1 F）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化過程中，PI3K/Akt 信號通路參與了 PDLSCs 中 Nrf2 的激活。

其次，在基于 TMT 的 LC-MS/MS 分析的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，HO1 和 SOD2（Nrf2 的下游抗氧化因子）之間潛在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可能與循環(huán)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化有關(guān)。之前的研究表明，循環(huán)機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)了 Nrf2 及其下游抗氧化劑 HO1 的表達(dá)。以下研究中評估了 PDLSCs 中 SOD2 的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示，SOD2 的 mRNA 和蛋白表達(dá)在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力過程中上調(diào)（圖2 A-C）。這些數(shù)據(jù)表明，PDLSCs中HO1和SOD2之間的潛在相互作用可能與循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨細(xì)胞分化有關(guān)。

為了進(jìn)一步證實在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力過程中HO1和SOD2的相互作用參與PDLSCs，進(jìn)行了Co-IP實驗。用抗 HO1 抗體進(jìn)行免疫沉淀實驗以富集含有 HO1 的蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后用抗 SOD2 抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，數(shù)據(jù)顯示 SOD2 存在于含有 HO1 的復(fù)合物中。根據(jù) Co-IP 實驗的結(jié)果（圖2 D），證實了HO1和SOD2之間的相互作用與循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化有關(guān)。
 

圖2 循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激下 PDLSCs 中HO1 和 SOD2的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
 

（A）循環(huán)機(jī)械應(yīng)力期間PDLSCs中SOD2的免疫熒光染色。（B）根據(jù)RT-PCR的結(jié)果，循環(huán)機(jī)械應(yīng)力上調(diào)PDLSCs中SOD2 mRNA的表達(dá)。（C）根據(jù)蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果，循環(huán)機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)了SOD2蛋白在PDLSCs中的表達(dá)。（D）Co-IP實驗表明，PDLSCs中HO1和SOD2之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分別作為抗HO1抗體和抗SOD2抗體的免疫沉淀來富集蛋白質(zhì)復(fù)合物。

之前的研究表明，Nrf2 對循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨細(xì)胞分化具有積極作用。最后為了驗證 Nrf2 可能是正畸治療中一個有前途的治療靶點，實驗將 t-BHQ、Nrf2 激活劑和 FDA 批準(zhǔn)的食品添加劑應(yīng)用于正畸大鼠，通過IHC染色檢測PDL中成骨相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平。結(jié)果表明，T-BHQ可促進(jìn)正畸大鼠張力側(cè)PDL中Nrf2及其下游抗氧化劑HO1的表達(dá)。t-BHQ 處理正畸大鼠中 ALP 和 COL1（成骨相關(guān)標(biāo)志物）的表達(dá)水平上調(diào)。這些結(jié)果表明，Nrf2 可能是有希望的治療干預(yù)靶點，對正畸中的牙槽骨重塑具有積極作用。

總之，Nrf2 激活通過 PI3K/Akt 通路和 HO1-SOD2 相互作用參與 PDLSCs 中循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化。Nrf2 激活劑 T-BHQ 增強(qiáng)了正畸大鼠張力側(cè)成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平。Nrf2可能是改善正畸治療中牙槽骨重塑的潛在且有希望的治療靶點。

參考文獻(xiàn)：Xi X, Li Z, Liu H, Chen S, Liu D. Nrf2 Activation Is Involved in Cyclic Mechanical Stress-Stimulated Osteogenic Differentiation in Periodontal Ligament Stem Cells via PI3K/Akt Signaling and HO1-SOD2 Interaction. Front Cell Dev Biol. 2022 Jan 6;9:816000. doi: 10.3389/fcell.2021.816000. PMID: 35071244; PMCID: PMC8770743.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35071244/

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