腎透明細胞癌致瘤機制：KDM5C基因缺失致使糖原代謝重編和抑制鐵死亡

文章標題：Deficiency of the X-inactivation escaping gene KDM5C in clear cell renal cell carcinoma promotes tumorigenicity by reprogramming glycogen metabolism and inhibiting ferroptosis

發(fā)表期刊：Theranostics

發(fā)表時間：2021.08.04

影響因子：11.556

合作客戶：武漢大學

百趣生物提供的服務：PPP、EMP靶標代謝流代謝組學檢測

研究背景
腎透明細胞癌 (ccRCC) 是最常見的腎癌形式，病癥表現(xiàn)為富含脂質(zhì)和糖原的細胞質(zhì)沉積物增加。研究表明，ccRCC中諸多基因位點發(fā)生突變，其中VHL基因和染色質(zhì)修飾基因KDM5C。盡管已證明VHL缺失可導致糖原累積，X染色體上KDM5C基因失活逃逸導致男性為主要患者，但其潛在機制仍不清楚。

此外，ccRCC患者存活率較低可能與磷酸戊糖途徑(PPP)的上調(diào)有關，因此糖原代謝可以作為治療靶點，但是，ccRCC中糖原累積和相關致癌功能的遺傳因素尚不完全清楚。

本文利用全外顯子組與RNA測序評估KDM5C在ccRCC中的功能，結(jié)合靶標代謝組學代謝流研究KDM5C如何影響細胞內(nèi)代謝通量。同時還對小鼠進行KDM5C基因敲除收集更多的體內(nèi)證據(jù)，揭示了組蛋白修飾基因失活突變重編程糖原代謝的機制，并有助于解決人類癌癥中男性占主導地位的長期難題。

研究內(nèi)容
具有最高糖原水平的 ccRCC 細胞系存在著 KDM5C 基因移碼突變

對ccRCC 6個細胞系進行高碘酸-希夫 (PAS) 染色和糖原定量測定發(fā)現(xiàn)，相比于其他同樣缺乏 VHL基因的癌細胞系，RCC4表現(xiàn)出最高的糖原水平（圖1 A、B）。此外，外顯子測序結(jié)果表明RCC4細胞中KDM5C和VHL出現(xiàn)移碼和錯義突變，WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)RCC4細胞中不存在KDM5C和VHL蛋白（圖1 C、D），由此表明癌細胞中的高糖原水平可能與KDM5C突變有關。

為了驗證KDM5C的恢復是否會降低RCC4細胞中的糖原水平，構(gòu)建了野生型KDM5C或其酶失活突變體H514A的RCC4細胞系，PAS染色結(jié)果和糖原定量測定結(jié)果表明KDM5C能有效降低糖原水平（圖1 E、F），KDM5C突變促進ccRCC中糖原的形成。

鑒于KDM5C是X失活逃逸基因，作者分析不同性別的患者的情況，發(fā)現(xiàn)在ccRCC中頻繁突變的基因中，KDM5C突變表現(xiàn)出最高的男女比例（圖1 G），KDM5C蛋白水平在ccRCC患者中下降，同時糖原顯著增加（圖1 H），這就解釋了為什么ccRCC患者大部分為男性。

圖1. X失活逃逸基因KDM5C在糖原水平最高的ccRCC細胞系中具有移碼突變

KDM5C缺失引起ccRCC特異性代謝組學表型

為了證實KDM5C缺失導致ccRCC發(fā)生和糖原積累，作者進行KDM5C敲除實驗。在對照組中，雌性腎臟中的KDM5C蛋白水平高于雄性（圖2 A）。相比于對照組，在50%的KDM5C敲除小鼠中觀察到腎囊腫（圖2 B），其管腔的上皮細胞顯示出強Ki67染色（圖2 C），KDM5C敲除小鼠的腎小管表現(xiàn)出細胞質(zhì)糖原累積升高（圖2 D）, 表明KDM5C缺失可能引發(fā)ccRCC特異性代謝組學表型并促進腫瘤形成。另外，KDM5C敲除穩(wěn)定細胞系的PAS染色和糖原定量結(jié)果均表明KDM5C耗盡后糖原水平增加（圖2 E-H）。

圖2. KDM5C敲除引發(fā)ccRCC特異性代謝表型

為了明確VHL和KDM5C兩者在糖原累積作用的聯(lián)系，作者另外對Caki-1細胞進行敲除實驗，發(fā)現(xiàn)VHL和KDM5C任何一種缺失都會導致糖原累積，二者同時敲除存在累加效應，表明KDM5C可能具有獨立于VHL/HIF的調(diào)節(jié)糖原的能力。（圖3）

圖3. 構(gòu)建的caki-1細胞系的糖原水平

KDM5C組蛋白去甲基化酶活性是其在調(diào)節(jié)參與糖生成、糖原分解和PPP的基因表達的作用所必需的

為了探索KDM5C在糖原代謝中的作用機制，作者對ACHN-shKDM5C、 RCC4-KDM5C細胞系以及對照組進行轉(zhuǎn)錄測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)KDM5C基因與中樞代謝、HIF反應、氨基糖代謝和轉(zhuǎn)錄失調(diào)相關，表明KDM5C對細胞代謝調(diào)節(jié)至關重要（圖4 A、B）。除此之外，鑒定了幾個參與糖原合成/降解和PPP的基因，包括HK2、GYS1、PGM1、PPP1R3C以及控制葡萄糖向PPP流動的關鍵基因G6PD，這些基因均在KDM5C敲除后表現(xiàn)出高表達，由此表明KDM5C可能會抑制ccRCC細胞中的HIF基因表達和葡萄糖向PPP分流（圖4 C-E）。

WB結(jié)果表明KDM5C表達會降低基因啟動子的H3K4me3水平（圖4 F），且KDM5C敲除會導致除了PPP1R3C之外的那些基因的啟動子上H3K4me3的水平增加（圖4 G），表明KDM5C能夠直接調(diào)節(jié)HK2、GYS1、PGM1和G6PD的基因表達。由此得到一個結(jié)論：KDM5C缺失導致H3K4me3水平提升進而促進糖原相關基因的表達。
 

圖4. KDM5C 抑制糖原代謝需要組蛋白去甲基化酶活性

KDM5C抑制葡萄糖向PPP的流動

盡管上述結(jié)果表明KDM5C可以同時調(diào)節(jié)糖原代謝和PPP，但其具體調(diào)控的方向仍不清楚。于是作者利用靶標代謝組學代謝流技術確認KDM5C抑制了葡萄糖向PPP的流動。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在恢復KDM5C的RCC4細胞中，G6P、6-PG、R5P、EMP的F6P和乳酸的同位素信號顯著減弱（圖5 A）,表明KDM5C抑制了葡萄糖向PPP的流動和糖酵解。此外，細胞內(nèi)代謝物定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)RCC4中的G6P水平高于其他ccRCC細胞系（圖5 B），KDM5C抑制了參與PPP和糖酵解的幾種產(chǎn)物的產(chǎn)生（圖5 C和D）。

百趣生物了解到，有趣的是，KDM5C同樣有效降低了G6P和NADPH的水平（圖5 E）, 盡管VHL降低了糖原含量，但未能降低G6P和NADPH的水平。與其他代謝物類似，KDM5C突變降低GSH水平。同樣，KDM5C缺失導致ccRCC細胞系的PPP底物G6P、PPP產(chǎn)物NADPH和GSH增加（圖4 F）。
 

圖5. KDM5C通過戊糖磷酸途徑抑制葡萄糖通量

KDM5C主要通過促進鐵死亡來抑制致瘤性

PPP在抗ROS活性和腫瘤侵襲上具有重大意義，其中間產(chǎn)物NADPH是鐵死亡的指標。為了明確KDM5C在ROS抗性和鐵死亡中的潛在作用，作者通過ROS誘導處理來比較各種ccRCC細胞系ROS抗性。與其他ccRCC細胞系相比，RCC4表現(xiàn)出相對較高的ROS抗性（圖6 A）。在用TBHP處理后，與RCC4-H514A細胞相比，RCC4-KDM5C有更多的細胞死亡（圖6 B）。同時，在TBHP誘導下，KDM5C導致ROS水平顯著增加（圖6 C）。此外，KDM5C顯著增強了Erastin介導的細胞死亡（圖6 B），這可以被Ferr-1或DFO有效逆轉(zhuǎn)，但不能被Z-VAD或Nec-1s逆轉(zhuǎn)。因此，與RCC4-H514A細胞相比，RCC4-KDM5C細胞中Erastin誘導的脂質(zhì)過氧化增加更明顯（圖6 D）。
 

圖6. KDM5C主要通過抑制鐵死亡來抑制致瘤性

KDM5C敲除賦予癌細胞對ROS和鐵死亡的抵抗力

敲除KDM5C后，與幾種ccRCC細胞系對TBHP和Erastin的抵抗力顯著增強（圖7 A、B）。值得注意的是，在糖原磷酸化酶抑制劑(GPI)會抑制其抗性（圖7 C），這表明KDM5C蛋白介導的糖原重編程的缺失對于抗ROS和鐵死亡是必不可少的。
 

圖7. KDM5C的缺失使老化的腎細胞和ccRCC細胞對鐵死亡具有抗性

癌癥相關的KDM5C突變在抑制糖原積累和促進鐵死亡方面存在缺陷

測序鑒定到大部分突變在JmjN和JmjC結(jié)構(gòu)域中富集（圖8 A），為了評估這些癌癥相關的KDM5C突變對糖原積累和鐵死亡的影響，選擇了幾個JmjN和JmjC結(jié)構(gòu)域相關的錯義突變，并構(gòu)建了穩(wěn)定表達突變蛋白的相應RCC4細胞系（圖8 A）。有趣的是，所有這些突變體都表現(xiàn)得像H514A，不能有效地降低糖原和G6P水平（圖8 B），并且它們都沒有使細胞對鐵死亡或ROS誘導劑敏感（圖8 C)。
 

圖8. 臨床相關的KDM5C突變體未能降低糖原水平并抑制鐵死亡

基于前面的結(jié)果，百趣生物發(fā)現(xiàn)作者提出了ccRCC中失活KDM5C突變的模型。如圖9所示，雌性KDM5C有兩個活性等位基因；因此，在單個基因改變后，雌性不會完全喪失基因。相比之下，在男性中，一個腎細胞突變使KDM5C基因的唯一等位基因失活，從而可能通過增加糖原生成/糖原分解和抑制鐵死亡來促進腫瘤發(fā)生。因此，男性更容易患ccRCC。
 

圖9. 失活KDM5C突變和ccRCC發(fā)病模型

結(jié) 論
該文章揭示了組蛋白修飾基因KDM5C失活突變重編程糖原代謝和隨后的PPP，并誘導了鐵死亡抗性，從而擴展了KDM5C功能庫，這些功能對于ccRCC的腫瘤發(fā)生至關重要，有助于解釋人類癌癥中男性占主導地位的長期難題。此外，該研究結(jié)果可能表明在ccRCC中靶向糖原代謝的治療價值。

文/阿趣代謝組學