由機械力刺激引起的正畸牙齒移動（OTM）是一種獨特的骨重塑過程，需要牙周韌帶（PDL）的參與。在牙齒移動過程中，在受壓側(cè)，PDL 被壓縮，牙槽骨被吸收，而骨沉積在與受力方向相反的張力側(cè)被激活。眾所周知，張力區(qū)的骨形成有助于牙齒運動的長期穩(wěn)定性。

牙周韌帶細胞（PDLCs）是 PDL 的主要組成細胞，可以分化成成骨細胞來合成骨組織。同時，PDLCs 還通過合成和釋放細胞因子、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)和集落刺激因子為骨沉積提供有利的微環(huán)境。此外，這些因素可能調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞的遷移、增殖和分化，已發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞遷移到機械負荷的牙周組織并參與移動牙齒周圍的骨重塑。盡管有這些發(fā)現(xiàn)，OTM 期間張力應(yīng)變誘導(dǎo)骨形成的機制仍不清楚。在湖北省口腔基礎(chǔ)醫(yī)學省部共建國家重點實驗室之前的研究中，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長因子2（FGF2）和基質(zhì)細胞衍生因子1（SDF-1）等特定生長因子和趨化因子顯著上調(diào)。cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）被進一步鑒定為該張力應(yīng)變激活反應(yīng)中的核心蛋白之一。

CREB 是一種亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，可通過與保守的啟動子序列（TGACGTCA）結(jié)合來調(diào)節(jié)許多 cAMP 反應(yīng)基因。CREB 通過調(diào)節(jié)多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞生長因子和細胞因子參與各種生物過程，包括細胞分化、增殖和遷移。

在本研究中，該團隊發(fā)現(xiàn) CREB 的表達和磷酸化在正畸張力應(yīng)變刺激下升高。此外，F(xiàn)GF2 和 SDF-1 的表達也上調(diào)。假設(shè) CREB 可能通過轉(zhuǎn)錄激活 SDF-1 和 FGF2 并增強 BMSCs 的遷移和分化。體外分析結(jié)果表明，PDLCs 中 CREB 的過表達上調(diào) FGF2 和 SDF-1 的表達，而 CREB 的抑制減弱了 FGF2 和 SDF-1 的升高。研究進一步探索了 CREB 如何反式激活 FGF2 和 SDF-1 啟動子，并在其啟動子中鑒定了 cAMP 調(diào)節(jié)的增強子元件（CRE）。
 

應(yīng)用正畸張力應(yīng)變的 PDLCs 增強 BMSCs 遷移和成骨分化

為了研究 BMSCs 在張力部位的功能，實驗生成了一個 OTM 小鼠模型。高倍放大圖像顯示張力部位的板層骨形成和骨腔周圍的圓形骨形成（圖1 A）。

為了更詳細地確定新骨的起源，比較了 PDL 中 Periostin（骨膜蛋白）、OCN 和 αSMA 的表達。OCN 被認為是成熟成骨細胞和骨形成率的標志物。骨膜蛋白已被視為牙周韌帶細胞的標志物。有研究提出，表達 αSMA 的祖細胞/干細胞位于 PDL 的血管周圍區(qū)域，可以分化為成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞和成纖維細胞。在移動牙齒的張力部位的 PDL 中，αSMA 的表達與骨膜蛋白的表達不重疊。αSMA 陽性（αSMA⁺）細胞和骨膜蛋白陽性（Periostin⁺）細胞均可檢測到 OCN（圖1 E）。這些結(jié)果表明，PDL 中 PDLCs 衍生的成骨細胞和 BMSCs 衍生的成骨細胞均參與骨形成。

為了更好地了解正畸牙齒移動過程中 PDLCs 和 BMSCs 之間的關(guān)聯(lián)，建立了一個張力應(yīng)變系統(tǒng)，對牙周韌帶細胞（PDLCs）施加循環(huán)張力應(yīng)變（CTS，重復(fù) 5 秒拉伸和 5 秒松弛，持續(xù)48小時）。從應(yīng)用 CTS 的 PDLCs 收集條件培養(yǎng)基并用于人類 BMSCs。與用對照培養(yǎng)基處理的相比，用 CTS 培養(yǎng)基處理的 BMSCs 顯示 ALP 染色和茜素紅染色增強（圖1 B）。同時，與對照處理相比，用 CTS 培養(yǎng)基處理 BMSCs 的細胞遷移率大大提高（圖1 C、D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，PDLCs 可以響應(yīng)機械張力應(yīng)變并增強 BMSCs 的遷移和分化。

圖1 應(yīng)用張力應(yīng)變的 PDLCs 增強了 BMSCs 的遷移和分化。

正畸張力應(yīng)變誘導(dǎo)的骨形成中 CREB 表達增加

為了檢查 CREB 是否參與正畸張力應(yīng)變誘導(dǎo)的骨形成，首先評估了其在機械負荷磨牙牙周組織中的表達。免疫組化染色顯示，OTM 小鼠在第 3、6、12 天的張力部位 P-CREB 表達顯著增加。在對照的對側(cè)部位觀察到較弱的免疫反應(yīng)（圖 2 A 、B）。

為了更詳細地確定 CREB 的起源，比較了第 3 天實驗 OTM 樣品中骨膜蛋白和 CREB 的表達。骨膜蛋白定位于 PDL。CREB 主要在 Periostin⁺ 細胞的細胞核中檢測到，表明 CREB 表達在除 BMSCs 之外的 PDLCs 中增加（圖2 C）。實時 RT-PCR 結(jié)果顯示，體外 CTS 刺激的 PDLCs 中 CREB 的 mRNA 水平在 24、48 和 72 小時顯著上調(diào)（圖2 D）。免疫印跡結(jié)果還顯示，CREB 和 P-CREB 的表達在 24 小時后顯著增加（圖2 E）。

實驗分析了 CTS 應(yīng)用的 PDLCs 中環(huán)磷腺苷（cyclic AMP）的產(chǎn)生。與未處理組相比，CTS 處理的 PDLCs 中環(huán)磷腺苷的表達從 12 小時到 48 小時持續(xù)增加并穩(wěn)定在 72 小時（圖2 F）。cAMP 對 CTS 的反應(yīng)趨勢與 CREB 相似但略早于 CREB。這些結(jié)果清楚地表明，在 OTM 期間，在正畸張力應(yīng)變誘導(dǎo)的骨形成期間，PDL 中 cAMP 和 CREB 的表達增加。
 

圖2 在正畸張力負荷下，CREB 在牙周韌帶中的表達增加。

正畸張力應(yīng)變刺激 PDLCs 中 FGF2 和 SDF-1 的表達

通過實時 RT-PCR 分析檢查了 CTS 處理的 PDLCs中 FGF2 和 SDF-1 的 mRNA 表達。結(jié)果顯示，24 小時后 FGF2 和 SDF-1 的 mRNA 表達上調(diào)（圖3 A、B）。此外，ELISA 結(jié)果顯示，與對照培養(yǎng)基相比，CTS 處理的 PDLCs 條件培養(yǎng)基中 FGF2 和 SDF-1 的濃度顯著增加（圖3 C、D）。此外還發(fā)現(xiàn)，OTM 模型中牙周韌帶張力部位的 FGF2 和 SDF-1 水平升高。免疫組化染色顯示，F(xiàn)GF2 的表達在第 3 天和第 6 天顯著增加，然后在第 12 天恢復(fù)正常（圖3 E、F）。SDF-1 在第 3 天高表達，然后在第 6 天和第 12 天減少（圖3 G、H）。

實驗比較了第 3 天實驗 OTM 樣品中骨膜蛋白和 FGF2 或 SDF-1 的表達。FGF2 和 SDF-1 主要在 Periostin⁺ 細胞中檢測到，表明 FGF2 和 SDF-1 是由除 BMSCs 以外的 PDLCs 分泌的（圖 4）。這些發(fā)現(xiàn)表明，機械張力可以誘導(dǎo) PDLCs 在張力部位表達和分泌 FGF2 和 SDF-1。

圖3 正畸張力負荷刺激牙周韌帶中 FGF2 和 SDF-1 的表達。

圖4 FGF2 和 SDF-1 在 OTM 小鼠模型中由 PDLCs 分泌。

CREB 增強 PDLCs 介導(dǎo)的 BMSCs 成骨和遷移

為了確定 PDLCs 中 CREB 表達是否可以調(diào)節(jié) BMSCs 的成骨和遷移，在 PDLCs 中生成了表達 CREB 或失去轉(zhuǎn)錄活性的顯性陰性形式的 CREB（KCREB）的慢病毒。免疫印跡結(jié)果顯示，CREB 和 KCREB 在慢病毒感染后在 PDLCs 中過表達。結(jié)果顯示，用來自 CREB 過表達 PDLCs 的條件培養(yǎng)基處理的 BMSCs 的遷移率顯著上調(diào)，而 KCREB 組的遷移率下調(diào)（圖5 A、B）。

此外，還檢查了它們對成骨細胞分化的影響。用來自 CREB 過表達的 PDLCs 的條件培養(yǎng)基處理，BMSCs 的 ALP 活性和礦化能力顯著上調(diào)；而用來自 KCREB 表達的 PDLCs 的條件培養(yǎng)基處理時，其下調(diào)（圖5 C、D）。這些數(shù)據(jù)表明，CREB 在 PDLCs 中的表達可能在調(diào)節(jié)信號分子分泌中發(fā)揮作用，從而增強 BMSCs 的遷移和成骨細胞分化。
 

圖5 CREB 增強 CTS-PDLCs 介導(dǎo)的 BMSCs 的成骨和遷移。

CREB 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) FGF2 和 SDF-1 的表達

為了研究 CREB 是否可以調(diào)節(jié) FGF2 和 SDF-1 的表達，對感染 PDLCs 的條件培養(yǎng)基進行了 ELISA 檢測。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF2 和 SDF-1 的表達在 CREB 過表達的 PDLCs 條件培養(yǎng)基中顯著上調(diào)，而在來自 KCREB 表達的 PDLCs 的條件培養(yǎng)基中下調(diào)（圖6 A、B）。SiRNAs 也被轉(zhuǎn)染到 PDLCs 中以抑制 CREB 的表達。實時 RT-PCR 結(jié)果顯示，在 siCREB-b 和 siCREB-c 轉(zhuǎn)染細胞中 CREB 表達顯著下調(diào)（圖6 C）。

使用 siCREB-c，檢查了 CREB 的抑制是否可以減弱 CTS 處理的 PDLCs 中 FGF2 和 SDF-1 的升高。ELISA 結(jié)果顯示，siCREB-c 降低了 CTS 處理的 PDLCs 條件培養(yǎng)基中 FGF2 和 SDF-1 的增加（圖6 D、E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，CREB 可能在 CTS 應(yīng)用的 PDLCs 中充當 FGF2 和 SDF-1 的上游調(diào)控因子。

實驗進一步探索了CREB 調(diào)控 FGF2 和 SDF-1 表達的機制，分析了 2 kb FGF2 和 SDF1 啟動子片段中的潛在調(diào)控元件。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF2 啟動子在 -1496bp∼-1489bp（m2）和 -47bp∼-40bp（m5）位點的突變大大降低了 CREB 轉(zhuǎn)錄激活（圖6 F）。對于 SDF-1 啟動子，-1203bp～-1196bp（m2）位點的突變大大減弱了轉(zhuǎn)錄激活（圖6 G）。這些發(fā)現(xiàn)表明，CREB 通過與 FGF2 啟動子的 -1496bp～-1489bp 和 -47bp～-40bp 位點的 CREs 相互作用來轉(zhuǎn)錄激活 FGF2 表達。它還通過與位于 SDF-1 啟動子的 -1203bp∼-1196bp 的 CRE 相互作用來激活 SDF-1 表達。
 

圖6 在張力應(yīng)變處理下，CREB 轉(zhuǎn)錄激活 FGF2 和 SDF-1 的表達。

總之，這些結(jié)果表明，CREB 在張力刺激下增加了 SDF-1 和 FGF2 的表達，從而調(diào)節(jié)了 BMSCs 的遷移和成骨細胞分化。研究對 CREB 調(diào)節(jié) SDF-1 和 FGF2 以促進骨形成的發(fā)現(xiàn)揭示了 OTM 期間張力部位骨形成的潛在機制。

參考文獻：Chang M, Lin H, Fu H, Wang J, Yang Y, Wan Z, Han G. CREB activation affects mesenchymal stem cell migration and differentiation in periodontal tissues due to orthodontic force. Int J Biochem Cell Biol. 2020 Dec;129:105862. doi: 10.1016/j.biocel.2020.105862. Epub 2020 Oct 10. PMID: 33045372.
原文鏈接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/33045372/

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