與其他心臟瓣膜一樣，房室二尖瓣是一個復雜的多層結構，每一層都包含特定的細胞外基質(zhì)（ECM）成分。二尖瓣由成纖維細胞樣細胞組成，稱為瓣膜間質(zhì)細胞（VIC），它們與 ECM 密切接觸，因此在每次心跳時都會發(fā)生影響瓣膜的機械變形，平均每年 4000 萬次。

粘液瘤二尖瓣（MMV）是最常見的心臟瓣膜疾病，65歲以后，其患病率顯著增加 。MMV 的特征是多個瓣膜結構的破壞、Ki-67 陽性增殖細胞的密度增加和 ECM 的改變，特別是纖維層中膠原纖維的積累和分解，彈性纖維的斷裂等。

目前越來越認識到機械應力是軟結締組織重塑的主要病因之一，包括在 MMV 中觀察到的病理性重塑。各種體外和離體研究調(diào)查了人類和動物 VIC 對機械負荷的表型反應�？傊�，它們顯示出 VIC 對 SMC 表型的激活，蛋白聚糖（PGs）、糖胺聚糖（GAG）和膠原蛋白的合成增加，以及蛋白水解酶的表達和活性增加。

盡管這些研究清楚地表明機械應力在瓣膜 ECM 重塑中起基本作用，但在人類二尖瓣 VIC 中很少研究將機械信號轉(zhuǎn)導成驅(qū)動組織重塑的生化信號的機制。比利時列日大學 GIGA 研究所的一項研究旨在識別受循環(huán)機械變形調(diào)控的基因以及參與其調(diào)控的下游信號通路。這些數(shù)據(jù)應該可以更好地理解 MMV 進展的機制，并可能揭示藥物治療的新靶點。
 

循環(huán)拉伸增加 TGFβ2、αSMA 和 CTGF/CCN2 的表達

將循環(huán)機械應變施加到 VIC 上，VIC 在補充有 0.1% FBS 的培養(yǎng)基中進行 14% 的循環(huán)等雙軸伸長，拉伸幅度保持在生理范圍內(nèi)，頻率為 1.16 Hz，持續(xù) 1、2、4 或 8 h。除機械拉伸（靜態(tài)培養(yǎng)）外，對照培養(yǎng)平行進行。通過 qRT-PCR 研究 MMV 和力學生物學相關基因的表達。

雖然 TGFβ1 的表達在任何時間點都沒有被機械拉伸改變（圖1 A ），但 TGFβ2 和 αSMA 的 mRNA 水平在拉伸 1 h 后顯著增加，然后恢復到靜態(tài)培養(yǎng)值（圖1 B-C）。

CTGF/CCN2 是一種基質(zhì)細胞蛋白。作為一種生長因子，它促進 ECM 積累并參與許多纖維化疾病。在實驗模型中，拉伸 1 h 和 2 h 后，在 mRNA 水平上已經(jīng)觀察到非常顯著的 CTGF 表達刺激（圖1 C），并持續(xù)到 4 和 8 h，并逐漸下降。蛋白質(zhì)印跡顯示，蛋白質(zhì)產(chǎn)生與 mRNA 水平平行，有輕微延遲（圖1 E-F）。這些數(shù)據(jù)清楚表明， CTGF 是一種特殊的機械響應標志物，有助于研究VIC對機械變形響應的分子機制。

在其他測試的基因中，TGFβ3、COL1A1、SOD1 和 MMP1，沒有發(fā)現(xiàn)在實驗條件下受到顯在調(diào)節(jié)。
 

圖1 機械拉伸誘導 TGFβ2、αSMA 和 CTGF 過表達：通過 qRT-PCR 檢測機械拉伸和靜態(tài)條件下，時間延長后 VIC 中 TGFβ1（A）、TGFβ2（B）、αSMA（C）和 CTGF（D）的表達。使用微管蛋白作為蛋白負荷控制，靜態(tài)（—）和拉伸（+）VIC 中 CTGF 產(chǎn)生的代表性蛋白質(zhì)印跡結果（E）。

小 RhoGTPase RhoC，但不是 RhoA，參與機械應力誘導的 CTGF 上調(diào)

RhoA 家族的小 GTPase 是關鍵的分子開關，參與細胞外環(huán)境和細胞骨架動力學發(fā)出的機械信號的轉(zhuǎn)導。實驗通過用 siRNA 沉默 RhoA、RhoC、Rac1 和 Cdc42 的表達，研究它們在機械應力誘導的 CTGF 上調(diào)中的作用。RhoA、RhoC 和 Rac1 的 SiRNA 有效且特異性地沉默了它們的靶標（圖2 A）。

在靜態(tài)細胞中，通過沉默 Rac1 和 RhoA 降低了 CTGF 的基礎水平，而抑制 RhoC 沒有影響（圖2 B）。然后，在每種情況下比較了循環(huán)拉伸（黑條）與靜態(tài)培養(yǎng)的效果。在對照細胞中，CTGF 的表達在循環(huán)拉伸時增加（圖2 B ）。盡管在 siRac1 和 siRhoA 轉(zhuǎn)染的 VIC 中基礎 CTGF 表達降低，但其通過拉伸誘導的倍數(shù)與對照細胞相似，甚至略高，表明 Rac1 和 RhoA 不參與拉伸誘導的 CTGF 上調(diào)。相比之下，轉(zhuǎn)染 siRhoC 的細胞沒有反應，這表明 RhoC 在機械拉伸觸發(fā)的調(diào)控中具有特定意義（圖2 B）。

為了進一步支持 RhoC 在機械信號轉(zhuǎn)導中的作用，進行了下拉測定，該測定允許測量 GTP 連接的活性 RhoC。如圖2 C-D 所示，在拉伸 10 分鐘后觀察到活性 RhoC 的比例增加。Y27632 是 ROCK1/2 的特異性強效抑制劑，ROCK1/2 是 RhoA 和 RhoC 的主要效應因子，作用于參與肌動蛋白聚合的下游通路。它沒有改變靜態(tài)條件下 CTGF 的基礎表達，但抑制了應激誘導的 CTGF 上調(diào)，無論是在 mRNA（圖2 E）或蛋白質(zhì)水平（圖2 F-G）。由于 RhoA 在這個過程中是可有可無的（圖2 B），這進一步證實了 RhoC 參與了 VIC 對機械信號的響應。
 

圖2 RhoC 通過 ROCK1/2 調(diào)節(jié)機械應力誘導的 CTGF 表達。

MEK/Erk 通路被機械應力激活，獨立于 RhoC 和 ROCK，并參與 CTGF 上調(diào)

在實驗模型中評估了細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Erk1/2），因為它們是細胞外環(huán)境發(fā)出的許多信號的關鍵二級信使。在機械拉伸 5 分鐘后已經(jīng)觀察到 Erk1/2 的快速和瞬時磷酸化（圖3 A），并在 15 分鐘后恢復到基礎值。U0126 對 Erk1/2 的上游激活劑 MEK 的抑制有效地抑制了 VIC 中 Erk1/2 的磷酸化。雖然這種抑制劑在靜態(tài)條件下沒有改變 CTGF 的基礎水平，但它在循環(huán)拉伸時完全消除了其 mRNA 和蛋白質(zhì)過表達（圖3 B-D）。

為了評估 MEK/Erk 通路的激活是否取決于 RhoC/ROCK 通路，在用 siRhoC 轉(zhuǎn)染并進行機械拉伸 10 分鐘的 VIC 中測量 Erk1/2 的磷酸化。如圖3 E 和 3F 所示，在拉伸條件下，在 siRhoC 和 siScramble 轉(zhuǎn)染細胞中，Erk1/2 磷酸化水平相似。因此，用 ROCK 抑制劑 Y27632 處理拉伸的 VIC 不會影響 Erk 1/2 的活化（圖3 G-H）。這些結果表明，通過機械應力激活 Erk1/2 通路與 RhoC/ROCK 軸無關。
 

圖3 MEK/Erk1/2 信號由機械應力激活，獨立于RhoC 和 ROCK，并參與應力誘導的 CTGF 表達。

循環(huán)拉伸誘導 MRTF-A 的核轉(zhuǎn)位

由于 RhoGTPases/ROCK1/2 是基于肌動蛋白的細胞骨架動力學的關鍵調(diào)控因子，假設機械拉伸可能通過招募球狀肌動蛋白分子刺激纖維肌動蛋白的形成，這將導致 MRTF-A（心肌素相關的轉(zhuǎn)錄因子A）從其與球狀肌動蛋白的復合物中釋放。一旦游離在細胞質(zhì)中，MRTF-A 就被轉(zhuǎn)運到細胞核中，在那里它與 SRF 結合以激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，特別是 CTGF。通過對靜態(tài)和拉伸狀態(tài)下細胞中的 MRTF-A進行免疫染色（圖4 A）和相對于細胞的總熒光定量核標記（圖4 B）來評估該過程。

在靜態(tài)培養(yǎng)中，>40% 的細胞的細胞核中 MRTF-A 含量非常低，只有 3% 的細胞具有更強的核標記。機械拉伸后，百分比完全相反，證明了 MRTF-A 的核易位。

MRTF-A 核易位抑制劑 CCG1423 抑制了拉伸細胞中 CTGF 的上調(diào)（圖5 A-C ），而不影響其在靜態(tài)培養(yǎng)物中的基礎表達。用顯示阻斷 CTGF 表達的 3 種抑制劑（Y-27632、CCG1423、U0126）處理拉伸培養(yǎng)物有效地消除了增加的 MRTF-A 核轉(zhuǎn)位（圖5 D-E）。
 

圖4 循環(huán)拉伸誘導 MRTF-A 核易位。具有低 MRTF-A 熒光的細胞核用箭頭表示，而那些具有強 MRTF-A 熒光的細胞核用星號表示（A）。在 4 個獨立實驗中，相對于對 58 個（靜態(tài)）和 45 個（拉伸）細胞測量的細胞總熒光（%），MRTF-A 的核熒光（nf）染色的細胞分布（%）（B）。
 

圖5 抑制 MRTF-A 易位消除了拉伸誘導的 CTGF 過表達。

CTGF 誘導細胞外基質(zhì)基因的表達

為了評估 VICs 是否可以對 CTGF 有反應，用重組人 CTGF 處理單層培養(yǎng)物。處理 48 h 后，已知 CTGF 靶基因 COL1A1 和纖維調(diào)節(jié)蛋白的表達顯著上調(diào)（圖6 A-B）。有趣的是，CTGF 還誘導了其自身表達和 CCN 家族的另一成員 Cyr61/CCN1 的表達（圖6 C-D）。

實驗最后測試了可能受 CTGF 調(diào)控的其他基因，例如 PAI-1、TIMP1 和蛋白聚糖，例如 versican、 biglycan、lumican 和 decorin。在實驗環(huán)境中，它們都沒有受到調(diào)節(jié)，顯示 VIC 對 CTGF 的反應具有特異性。
 

圖6 CTGF 促進ECM基因及其自身的表達。在用人重組 CTGF（30 ng/ml）處理 48 小時的 VIC 中測量 COL1A1（A）、纖維調(diào)節(jié)蛋白（B）、CTGF（C）和 Cyr61（D）mRNA 的表達。
 

圖7 圖形概要

總之，該研究結果首次顯示 RhoC/ROCK/MRTF-A 軸的核心作用，它與 MEK/Erk1/2 一起通過機械應變調(diào)節(jié)二尖瓣膜間質(zhì)細胞中促纖維化表型的誘導。一系列的 MRTF-A 抑制劑已開發(fā)和證明是治療硬皮病等纖維化疾病的潛在新療法。根據(jù)該實驗的原始數(shù)據(jù)，MMV 的藥理學治療是否可以成為這些抑制劑的另一種治療應用是值得研究的。

參考文獻：Blomme B, Deroanne C, Hulin A, Lambert C, Defraigne JO, Nusgens B, Radermecker M, Colige A. Mechanical strain induces a pro-fibrotic phenotype in human mitral valvular interstitial cells through RhoC/ROCK/MRTF-A and Erk1/2 signaling pathways. J Mol Cell Cardiol. 2019 Oct;135:149-159. doi: 10.1016/j.yjmcc.2019.08.008. Epub 2019 Aug 20. PMID: 31442470.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31442470/

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