細(xì)胞外囊泡EVs熒光標(biāo)記的機(jī)遇與挑戰(zhàn)
細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)在機(jī)體的多種生理病理過程中均發(fā)揮著重要作用，良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物相容性及天然的轉(zhuǎn)運(yùn)能力使其成為理想的藥物遞送載體和治療制劑。不管是在工業(yè)生產(chǎn)還是科學(xué)研究中，EVs的質(zhì)量控制都至關(guān)重要，國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(international society for extracellular vesicles, ISEV)一直在努力推動和完善相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，如MISEV2014、MISEV2018以及即將發(fā)布的MISEV2022，同時(shí)工業(yè)界也試圖確立適用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。除了粒徑、濃度等常規(guī)物理參數(shù)的檢測，更重要的是對EVs的純度、蛋白標(biāo)志物、核酸以及載物等功能性分子進(jìn)行表征，而內(nèi)容物的定性定量分析通常需要通過熒光標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)。
近日Lonza集團(tuán)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)發(fā)表了題為“Opportunities and Pitfalls of Fluorescent Labeling Methodologies for Extracellular Vesicle Profiling on High-Resolution Single-Particle Platforms”的文章，作者分別利用高分辨單顆粒表征平臺nFCM(NanoFCM)和F-NTA對EVs進(jìn)行表征，探討EVs熒光表征過程中面臨的問題與挑戰(zhàn)。文章對EVs純度測定過程中染料的選擇、蛋白標(biāo)志物分析、RNA檢測、復(fù)雜體系中EVs的表征等方面進(jìn)行全面研究，指出在EVs綜合表征中面臨的問題與注意事項(xiàng)，供廣大EVs研究者參考。
EVs純度鑒定
首先，分別選取兩種細(xì)胞膜染料和兩種細(xì)胞質(zhì)染料對EVs的純度進(jìn)行鑒定。nFCM結(jié)果顯示，無論是細(xì)胞膜染料(CMG/CMR)還是細(xì)胞質(zhì)染料(CFSE/CTR)，EVs陽性顆粒的比例均高達(dá)90%左右，且EVs尺寸越大，結(jié)合的染料越多，熒光強(qiáng)度也越高。由于具備超高的散射和熒光靈敏度，nFCM證實(shí)了幾種染料標(biāo)記效率的一致性(圖1)。同樣的樣品和染色方法用F-NTA檢測，經(jīng)CFSE標(biāo)記的EVs陽性率為88%，與nFCM結(jié)果相當(dāng)，而對于CMG染料標(biāo)記，F(xiàn)-NTA測得的陽性顆粒比例只有32%左右，粒徑分布顯示F-NTA檢測到的是大的EVs。這個(gè)案例提醒研究者對于EVs純度分析不僅需要關(guān)注不同染料間的標(biāo)記和檢測效率問題，還需要關(guān)注表征平臺的檢測能力。
圖1.不同染料標(biāo)記EVs純度的效率
在早期的推文中小編介紹過不同公司的抗體特異性存在差異重磅！安德森癌癥中心用NanoFCM直篩外泌體特異性抗體！，抗體標(biāo)簽也是影響EVs標(biāo)記效率的一個(gè)因素。該研究對比了PE、AF488、AF647、APC四種標(biāo)簽的CD9抗體，發(fā)現(xiàn)PE和AF488的標(biāo)記比例優(yōu)于AF647和APC，比例在50%左右；進(jìn)一步選用PE和AF488兩種標(biāo)簽的CD9、CD63和CD81抗體，發(fā)現(xiàn)在HT29和HEK293細(xì)胞系中不同標(biāo)簽抗體標(biāo)記的效果沒有顯著差別(圖2)，說明在EVs蛋白標(biāo)記過程中研究者需要格外關(guān)注抗體特異性、標(biāo)簽的選擇對標(biāo)記效率的影響。
圖2.不同熒光標(biāo)簽對抗體標(biāo)記效率的影響
除了抗體標(biāo)簽，未結(jié)合的抗體對EVs的陽性率也存在影響。文章對比了稀釋法(Dilution)、超濾(UF)、尺寸排阻(SEC)三種方法對游離抗體去除效果和標(biāo)記比例的影響。由于不涉及純化過程，理論上稀釋法對EVs的影響是最少的。nFCM結(jié)果顯示三種方法得到的CD9、CD63、CD81陽性率基本一致，說明稀釋法可以用來準(zhǔn)確地測定EVs蛋白的比例，同時(shí)結(jié)果也證明UF和SEC純化過程對EVs蛋白的陽性率沒有影響(圖3)。說明nFCM可通過稀釋法測定EVs蛋白表達(dá)比例，省略超速離心去除游離抗體的操作，極大縮短操作時(shí)間，同時(shí)真實(shí)反映EVs蛋白表達(dá)比例和強(qiáng)度。
圖3.nFCM測定游離抗體去除方法對標(biāo)記比例的影響
前面介紹的案例都是基于EVs純品的分析，雜質(zhì)顆粒含量非常低，對測定結(jié)果的影響相對較小。進(jìn)一步對較復(fù)雜的細(xì)胞上清(CCM)進(jìn)行直接檢測，作者指出對于EVs純品和CCM樣品，nFCM的結(jié)果令人驚訝的一致，CFSE與CMG陽性率例均在90%左右，與超離純化的 HT29 EVs樣品結(jié)果一致，說明nFCM平臺既適用于純的EVs樣品，也可用于細(xì)胞上清樣品中EVs的直接檢測，具有廣泛的應(yīng)用場景；而在F-NTA平臺，CFSE與CMC對于HT29細(xì)胞上清EVs標(biāo)記陽性率分別為33%和27%，作者解釋稱可能是由于CCM樣品復(fù)雜的成分導(dǎo)致F-NTA的檢測存在差異；對于蛋白比例檢測，3種EVs蛋白marker總比例高達(dá)188.5%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過100%，文章指出可能是F-NTA熒光的靈敏度高于散射，大量小顆粒的散射信號未檢出，導(dǎo)致比例高于100%。
圖4.CCM樣品EVs純度和蛋白比例測定
與F-NTA相比，nFCM還可以利用多色熒光標(biāo)記策略對sEV亞群進(jìn)行表征。為研究EVs的抗體單標(biāo)和雙標(biāo)之間是否相互影響，作者選取CD9-AF488和CD81-PE分別進(jìn)行單獨(dú)標(biāo)記和雙標(biāo)，對比標(biāo)記比例的變化。結(jié)果表明這兩個(gè)蛋白之間，不管是單獨(dú)標(biāo)記或雙標(biāo)，陽性率差異不顯著；另外，用EVs染料CTR和CD81同時(shí)標(biāo)記EVs，發(fā)現(xiàn)所有CD81陽性的EVs的CTR均呈現(xiàn)陽性，說明CD81陽性的顆粒，均是EVs！(圖5)。nFCM可以準(zhǔn)確識別抗體標(biāo)記的所有EVs，并且確認(rèn)抗體陽性率的準(zhǔn)確性。
圖5.EVs抗體單標(biāo)和雙標(biāo)的影響
綜上，Lonza集團(tuán)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)對EVs熒光標(biāo)記過程中的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合對比，對EVs純度測定過程中染料的選擇、蛋白標(biāo)志物分析、復(fù)雜體系中EVs的表征等進(jìn)行研究，對工業(yè)生產(chǎn)中EVs的質(zhì)量控制提供了新思路和新方法。
作者肯定了nFCM用于EVs檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度，提出EVs純度表征方法，初次采用CD9/63/81幾種抗體的混合物驗(yàn)證EVs的純度，并對細(xì)胞上清中的EVs進(jìn)行直接檢測，得到了跟EVs純品相一致的結(jié)果。另外作者指出nFCM對于EVs熒光檢測具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性(圖6)，nFCM可在單顆粒水平對EVs的散射和熒光進(jìn)行同時(shí)檢測，單次采樣即可實(shí)現(xiàn)蛋白與EVs(或蛋白間)的“共定位”分析，是EVs質(zhì)量控制中不可或缺的工具。
圖6.文中關(guān)于nFCM的評價(jià)
Lonza Walkersville(龍沙集團(tuán))是全球CDMO龍頭企業(yè)，一家以生命科學(xué)為主導(dǎo)，在生物化學(xué)、精細(xì)化工、功能化學(xué)等行業(yè)均處于領(lǐng)先地位的全球性跨國公司，具有一百多年歷史，總部位于瑞士巴塞爾。
圖7.Lonza集團(tuán)EVs工作流程圖(圖片來源：Lonza官方網(wǎng)站)
Lonza目前已采購3臺NanoFCM，分別用于EVs研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控和CRO項(xiàng)目，致力于EVs大規(guī)模生產(chǎn)、純化和表征，后續(xù)將應(yīng)用于EVs載藥領(lǐng)域。2021年11月，Lonza收購了Codiak公司位于馬薩諸塞州Lexington的外泌體生產(chǎn)基地，正式成為Codiak管線的戰(zhàn)略制造合作伙伴。屆時(shí)Lonza將借助Codiak的高通量外泌體生產(chǎn)技術(shù)向第三方提供服務(wù)，并開發(fā)先進(jìn)的外泌體產(chǎn)品，助力細(xì)胞與基因治療產(chǎn)業(yè)。
參考文獻(xiàn)：
- Fortunato D, Mladenović D, Criscuoli M, et al. Opportunities and Pitfalls of Fluorescent Labeling Methodologies for Extracellular Vesicle Profiling on High-Resolution Single-Particle Platforms[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(19): 10510.
- https://www.lonza.com/
- https://www.lonza.com/news/2021-11-02-13-01
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