在上一篇推文《細(xì)胞外囊泡——下一代藥物遞送平臺》中，小編介紹了細(xì)胞外囊泡在藥物遞送領(lǐng)域的優(yōu)勢及挑戰(zhàn)。今天，小編將介紹外泌體，主要是干細(xì)胞外泌體在組織修復(fù)和再生中的應(yīng)用潛能及挑戰(zhàn)。
作為全球的焦點和熱點，干細(xì)胞是生命科學(xué)的前沿，也是治療重大的難治性疾病的新的技術(shù)手段，且干細(xì)胞移植被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)中很有潛力的方法之一，目前全球已經(jīng)有十幾款干細(xì)胞產(chǎn)品獲批上市。近期，國際干細(xì)胞研究學(xué)會（ISSCR）發(fā)布了2021年更新版《干細(xì)胞研究和臨床轉(zhuǎn)化指南》，把干細(xì)胞的臨床轉(zhuǎn)化標(biāo)準(zhǔn)化推向了新的高度。國內(nèi)方面，雖然尚無上市的干細(xì)胞治療產(chǎn)品，“干細(xì)胞研究與器官修復(fù)”已列入“十四五”國家重點研發(fā)計劃，國內(nèi)干細(xì)胞領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)也在逐步發(fā)展和不斷完善中。2021年3月，中國細(xì)胞生物學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)工作委員會發(fā)布了6項干細(xì)胞領(lǐng)域團體標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)干細(xì)胞相關(guān)的臨床研究的備案審核有了更清晰的依據(jù)。
同時我們也清醒地意識到，由于干細(xì)胞存在致瘤性、促炎癥和宿主排斥等風(fēng)險，狹義的干細(xì)胞治療的安全性仍然是臨床上面臨的挑戰(zhàn)。目前，有大量研究證明，干細(xì)胞來源的外泌體中含有干細(xì)胞的生物活性物質(zhì)，能夠替代干細(xì)胞發(fā)揮器官及組織損傷修復(fù)等重要的生物學(xué)功能。盡管長期以來被忽略，但干細(xì)胞外泌體的應(yīng)用在干細(xì)胞移植中避免了多種潛在風(fēng)險，且外泌體具有先天無免疫原性、便于保存和運輸?shù)忍攸c，作為“無細(xì)胞的干細(xì)胞治療技術(shù)”顯示出得天獨厚的優(yōu)勢，所以許多傳統(tǒng)的干細(xì)胞治療開發(fā)者們開始轉(zhuǎn)向干細(xì)胞外泌體這一“副產(chǎn)物”來尋求更好的解決方案。除了國家在基金層面的大力支持，干細(xì)胞外泌體領(lǐng)域也吸引了越來越多的產(chǎn)業(yè)化基金，許多致力于干細(xì)胞治療的知名公司和制藥巨頭都瞄準(zhǔn)了外泌體這一黃金賽場，紛紛增加外泌體相關(guān)的管線，推動該領(lǐng)域的飛速發(fā)展。
細(xì)胞外囊泡 (EVs) 是一類包載了核酸、蛋白質(zhì)、脂類等生物活性分子的膜性囊泡，其內(nèi)含物在一定程度上類似于其來源母細(xì)胞，是細(xì)胞間信號傳輸?shù)妮d體。根據(jù)分泌途徑的不同，EVs 主要分為外泌體和微囊泡兩大類，由于國內(nèi)讀者習(xí)慣稱呼“外泌體”，故文中不對 EVs 與外泌體做明顯區(qū)分。有研究表明，細(xì)胞外囊泡的蛋白質(zhì)和 RNA，可介導(dǎo)靶向細(xì)胞間的信號傳遞，甚至遺傳信息的功能性轉(zhuǎn)移，這一發(fā)現(xiàn)極大地促進了細(xì)胞外囊泡在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。
 

圖1. 細(xì)胞外囊泡示意圖

一、EVs作為再生制劑的潛能

EVs 包含著多種生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等，其攜帶的內(nèi)含物在一定程度上類似于其來源母細(xì)胞。EVs 本質(zhì)是異質(zhì)性群體，大小不均一，成分復(fù)雜，不同組織和細(xì)胞之間的活性分子可能會有所不同。幾乎所有的細(xì)胞都會分泌 EVs，其中間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）由于其旁分泌機制發(fā)揮治療作用成為再生應(yīng)用中流行的 EVs 細(xì)胞源。盡管 MCS 分泌的外泌體是研究中常見的類型，但也存在其他細(xì)胞來源如胚胎誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，組織特異性干細(xì)胞以及初級前體和成熟細(xì)胞等分泌的外泌體成功應(yīng)用于再生治療中。由于 EVs 具有良好的生物相容性以及低免疫原性等優(yōu)點，EVs 作為潛在的治療制劑在組織修復(fù)和再生中獲得了廣泛的關(guān)注，越來越多的研究評估了它們對各種器官和組織修復(fù)和再生的適用性

1.EVS具有再生潛力
細(xì)胞外囊泡作為天然的大分子載體，其再生潛力主要歸因于對免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移、分化、血管生成和組織極性的調(diào)節(jié)。有多項研究研究表明，EVs 主要通過其攜帶的生物分子在不同組織和器官中誘導(dǎo)再生和治療效果。天然的 EVs 攜帶的表面的膜蛋白或負(fù)載蛋白和核酸分子如 mRNA、miRNA等可在結(jié)合和細(xì)胞內(nèi)化后激活靶細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的遷移能力、耐藥能力等。如來源于間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cell, MSC）的 EVs 通過傳遞 miRNAs 可減少角膜纖維化和炎癥；對MSC-EVs 蛋白質(zhì)組的研究表明，它們含有可以介導(dǎo)血管生成、凝血、細(xì)胞凋亡、炎癥以及組織再生的蛋白質(zhì)。因此，EVs 攜帶的內(nèi)含物在再生醫(yī)學(xué)上具有巨大的應(yīng)用潛能。

2.干細(xì)胞EVS工程化改造
細(xì)胞外囊泡作為藥物遞送的載體，有著適應(yīng)生理環(huán)境的優(yōu)勢。然而天然 EVs 可攜帶的藥物種類和數(shù)量有限，這給 EVs 在再生治療的應(yīng)用帶來了挑戰(zhàn)。目前，通過現(xiàn)有的基因工程技術(shù)和手段如共孵育、轉(zhuǎn)染、電穿孔、超聲處理和原位合成等各種策略實現(xiàn) EVs 的改造。通過對 EVs 包裹的核酸或膜表面蛋白進行重組、改造、修飾或更新，可以給 EVs 賦予新的功能和作用。
（1）利用干細(xì)胞 EVs 作為載體遞送藥物用于疾病治療是目前較為常見的研究類型。上海第六人民醫(yī)院 Zhu 等嘗試在胚胎干細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)加載紫杉醇（paclitaxel, PTX）用于惡性腦膠質(zhì)瘤的治療并取得一定的成功。研究中對胚胎干細(xì)胞外泌體粒徑、活性、以及藥物的裝載效率等物理生化性質(zhì)的進行分析。發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞來源的外泌體對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抑制作用。并且通過工程化手段對外泌體進行修飾（修飾 cRGDyK 肽段）使其能夠靶向腫瘤組織，通過納米流式檢測儀直觀的觀察到修飾前后外泌體的粒徑變化。同時在外泌體內(nèi)部裝載紫杉醇藥物后，可提高外泌體抗膠質(zhì)瘤的能力，為治療惡性膠質(zhì)瘤和其他類型腫瘤疾病的研究提供新的思路。下圖是借助納米流式檢測儀 (NanoFCM) 發(fā)表的部分研究結(jié)果。
 

圖2. 胚胎干細(xì)胞外泌體粒徑分布、ESC-EXO活性結(jié)果、凋亡情況

（2）牛奶來源的 EVs 比干細(xì)胞來源 EVs 更易獲取且成本更低，應(yīng)用廣泛。如 Chen 等以乳源性 EVs(mEVs) 為模型，基于細(xì)胞外囊泡表面修飾，開發(fā)了一種通用且溫和的表面功能化方法，證明可以在不破壞 mEVs 結(jié)構(gòu)的前提下，將多種配體固定在其表面。利用 NanoFCM 單顆粒檢測的優(yōu)勢，揭示了純化前后的偶聯(lián)效率以及改性 mEV 的異質(zhì)性。此外，細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性實驗表明結(jié)合配體的 mEVs 細(xì)胞靶向性和貨物輸送能力顯著提高，體內(nèi)成像實驗進一步證明了轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)技術(shù)在提高mEVs 腫瘤區(qū)域富集能力的適用性。總的來說，這種修飾方法能夠?qū)崿F(xiàn)食品源性細(xì)胞外囊泡 (FDEVs) 表面的有效功能化，將有望加速基于 EVs 表面修飾的療法的發(fā)展。
 

圖3. mEVs異質(zhì)性及轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合mEVs的偶聯(lián)效率分析

EVs 作為藥物載體，可高效向特異損傷的組織器官遞送治療物質(zhì)，為組織器官再生治療提供了新思路，目前已經(jīng)累積了許多成功的案例。表1對不同器官系統(tǒng)中 EVs 的治療案例進行了總結(jié)。這些案例證實不管是天然的 EVs 還是經(jīng)過工程化改造的EVs 在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均能帶來更多、更大的驚喜。

表1.目前針對不同系統(tǒng)的EVs再生治療案例

二、EVs在體內(nèi)分布、安全性及表征技術(shù)挑戰(zhàn)
有研究認(rèn)為 EVs 在體內(nèi)的生物分布取決于其來源母細(xì)胞，EVs表面的分子組成、給藥途徑等亦可顯著影響其生物分布。例如，小鼠體內(nèi)靜脈注射后優(yōu)先在肝臟、脾臟、胃腸(GI)道和肺中積累，樹突狀細(xì)胞分泌的 EVs 優(yōu)先被脾臟吸收，而間充質(zhì)干細(xì)胞來源的 EVs 在肝臟和脾臟中積聚。目前脂質(zhì)納米粒子在體內(nèi)和體外遞送的有效性和生物相容性已得到廣泛的關(guān)注。與脂質(zhì)納米粒子相比，EVs 作為藥物的載體具有更大載藥能力、調(diào)節(jié)和靶向特定的組織以及安全性和藥代動力學(xué)等方面的優(yōu)勢。截至目前，鮮有關(guān)于 EVs 給藥后副作用的報道，因此，可以認(rèn)為干細(xì)胞 EVs 給藥基本安全。同時，由于 EVs 的大小不均一、成分復(fù)雜，在 EVs 的綜合表征和質(zhì)量保證方面存在局限性，限制了 EVs 臨床轉(zhuǎn)化的進程。
目前，利用集權(quán)平均的方法分析 EVs，可確定大量的 EVs 內(nèi)含有不同的生物分子。但是 EVs 尺寸微小，異質(zhì)性大，單個 EVs中攜帶的載物數(shù)量存在一定的限制，且不同來源的 EVs 含量也存在顯著差異。細(xì)胞外囊泡作為再生制劑，若其中包含過多非功能性成分很可能會降低其治療效果，且治療時常需要使用更高劑量。因此，對囊泡生物分子基于單顆粒水平的分析將比利用集權(quán)平均的表征更有助于判斷 EVs 作為治療制劑的療效。并且基于單顆粒水平的分析技術(shù)更有望促進 EVs 亞群以及具有生物活性的 EVs 亞群的識別和表征。

三、EVs再生療法的臨床應(yīng)用與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展
目前，全球范圍內(nèi)的臨床試驗數(shù)據(jù)庫中注冊了數(shù)十項涉及 EVs的研究,但大多數(shù)旨在監(jiān)測循環(huán) EVs 作為疾病的生物標(biāo)志物、疾病進展和應(yīng)用治療的有效性。表2總結(jié)了 EVs 用于組織再生修復(fù)的案例，臨床試驗多處于I期或II期，目的是為了評估用于治療的 EVs 的安全性和有效性。而 COVID-19 的大流行推進了多項MSC 衍生的 EVs 臨床試驗的啟動，旨在減輕患者在感染 SARS-CoV-2 病毒后的并發(fā)癥。這些試驗的結(jié)果無疑將有助于進一步了解 EVs 在免疫調(diào)節(jié)中的臨床價值。同時，也有不少公司積極投入到EVs的治療產(chǎn)品的開發(fā)中，其中 Capricor Therapeutics、Aegle Therapeutics、United Therapeutics和Exopharm等公司利用 EVs 作為組織修復(fù)的生物治療制劑進行臨床試驗，余下的大部分公司預(yù)計未來幾年將會陸續(xù)進行人體研究。此外，利用細(xì)胞外囊泡的再生特性生產(chǎn)的產(chǎn)品在化妝品和護膚領(lǐng)域的應(yīng)用中也受到了持續(xù)且廣泛的關(guān)注。
由于 EVs 療法的創(chuàng)新性，其臨床分級、生產(chǎn)質(zhì)控以及在應(yīng)用上缺乏世界公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。因此，EVs 產(chǎn)業(yè)化發(fā)展還需克服以下幾個方面的限制：

（1）建立適用于臨床大規(guī)模制備、純化和儲存的分離方案；
（2）EV的量化、分子和物理表征的標(biāo)準(zhǔn)化方法；
（3）明確臨床使用的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等。

表2. 臨床中應(yīng)用于組織修復(fù)和再生的EVs制劑

四、總結(jié)與展望
細(xì)胞 EVs 作為一種嶄新的治療方法具有在組織損傷修復(fù)及再生的應(yīng)用及其他疾病治療的治療潛力。體內(nèi)和體外研究認(rèn)為，EVs 通過促進細(xì)胞增殖、分化和血管生成以及抑制細(xì)胞凋亡和炎癥來介導(dǎo)組織修復(fù)。但是由于缺乏有效的表征技術(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)化的分離方法，EVs 是如何促進組織再生以及是什么驅(qū)動它們再生作用的機制仍遠(yuǎn)未闡明。此外，由于其復(fù)雜的藥代動力學(xué)，需要進一步的去探索其作為治療制劑在再生效應(yīng)中發(fā)揮作用的機理。因此，在單顆粒水平對 EVs 進行表征分析，并剖析不同EVs亞群的特定內(nèi)含物，及其特定的生物學(xué)作用，將有助于更好地定義用于組織修復(fù)和再生的 EVs 制劑的作用機制。
作為一款“為外泌體為生”的檢測設(shè)備，納米流式檢測儀(NanoFCM)可在單顆粒水平對 40-1000 nm 的 EVs 進行單顆粒分析，具有與電鏡結(jié)果相媲美的分辨率。NanoFCM 還是一款省時，省樣品又省力的檢測儀器。對于樣品的實際消耗只需0.1 μL ，1min即可實現(xiàn)樣品檢測，一步檢出粒徑分布、顆粒濃度以及陽性表達率等。
總的來說，不僅可對 EVs 的顆粒濃度、粒徑分布、載藥量、蛋白、核酸等物理生化性質(zhì)進行分析，還對 EVs 的生產(chǎn)過程進行質(zhì)量控制，優(yōu)化生產(chǎn)條件、提高載藥效率。同時可對 EVs 在生產(chǎn)后的穩(wěn)定性進行評價，評估不同存儲條件對 EVs 的影響。NanoFCM 的應(yīng)用貫穿整個 EVs 制劑研發(fā)、大規(guī)模生產(chǎn)、分離純化、質(zhì)控、穩(wěn)定性評估等整個過程，極大加速 EVs 產(chǎn)品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化進程！

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