圖1. EVs的作用方式和功能
 

圖2. EVs的種類
 

圖3. EVs生產(chǎn)過程中的工藝環(huán)節(jié)和關(guān)鍵步驟
 

1.EVS來源的細胞培養(yǎng)和表征
EVs 生產(chǎn)可以從傳統(tǒng)生物制劑(即抗體和蛋白質(zhì)生產(chǎn))和細胞治療的發(fā)展中獲益。親本細胞的選擇和培養(yǎng)條件是上游工藝的關(guān)鍵步驟。目前，對于 EVs 生產(chǎn)的較佳技術(shù)還沒有達成共識，仍需要根據(jù) EVs 的活性、組織歸巢特性、潛在的免疫原性以及致瘤性來選擇親本細胞。此外，遺傳穩(wěn)定性、宿主細胞雜質(zhì)(如病原體，特別是病毒)和 EV 產(chǎn)量也是在親本細胞的選擇過程中需要考量的因素。一旦選好親本細胞，就可以通過培養(yǎng)，產(chǎn)生大量具有合適表型的EVs。
關(guān)于親本細胞的培養(yǎng)，建議使用的方法包括多層培養(yǎng)瓶，生物反應(yīng)器和中空纖維筒等。對于小規(guī)模的人工生產(chǎn)，可以在搖瓶、轉(zhuǎn)瓶、滾動瓶，細胞培養(yǎng)袋或生物反應(yīng)器中進行細胞擴增。對于大規(guī)模的細胞培養(yǎng)，細胞可以生長在不銹鋼生物反應(yīng)器(高可達20,000L 規(guī)模)、搖桿平臺細胞培養(yǎng)袋(高可達 500 L 規(guī)模)，甚至生物反應(yīng)器(高達 2,000 L規(guī)模)。從過程安全的角度來考慮，封閉系統(tǒng)是優(yōu)先選擇；然而，這些系統(tǒng)比開放系統(tǒng)更難監(jiān)控。培養(yǎng)過程中需要密切監(jiān)測遺傳漂變和污染，遵循用于生產(chǎn)生物制品和細胞治療的方案。同時，越來越多的證據(jù)表明，牛奶可能是一個高效、大量獲取 EVs 的來源，雖然使用牛奶 EVs 作為藥物載體的可行性研究正在進行，但從復(fù)雜牛奶中大規(guī)模分離純囊泡的方法仍然需要優(yōu)化。

2. EVS藥物裝載方式
目前裝載藥物在 EVs 內(nèi)部方法主要有如下兩種：(本文因篇幅所限,沒辦法對EVs藥物裝載方式展開詳細說明,后續(xù)官方微信公眾號會有專題報道,敬請期待!)
(1)內(nèi)源表達：通過細胞內(nèi)源表達，使蛋白或RNA等藥物被分選進入 EVs。這種方式可以降低載藥的難度，簡單有效地實現(xiàn)藥物裝載。例如：Codiak 公司利用 NanoFCM 篩選出表達比例超過 95% 的PTGFRN 和 BASP1 這兩個支架蛋白(如圖4)，這兩個蛋白幾乎在所有外泌體中都有表達，實現(xiàn)了藥物的高效遞送。目前用 PTGFRN裝載的 exoIL-12 是進入臨床試驗的工程化外泌體候選藥物(2020年9月該藥物進入I期臨床試驗，在文章投稿之后，所以沒有統(tǒng)計在列表中)。而BASP1表達在外泌體內(nèi)部，可以實現(xiàn)小分子藥物的遞送。另外，重要的是可以利用細胞自身的表達系統(tǒng)，源源不斷地表達 IL-12，并且裝載到外泌體中，利用 PTGFRN 抗體親和純化復(fù)雜成分的細胞上清外泌體，避免超速離心等純化方法對外泌體的損傷，極大提高外泌體的生產(chǎn)效率、純度和穩(wěn)定性。
 

圖4. Codiak公司外泌體候選藥物ExoIL-12

(2)外部裝載：在 EVs 純化后，通過機械或化學(xué)技術(shù)暫時打開 EVs 的膜，使化合物擴散到囊泡中。最常見的方法包括超聲、電穿孔、皂素處理和孵育等。這種載藥方法比內(nèi)源表達的方法復(fù)雜，且有載藥效率不可控，需要去除未裝載的藥物等缺點。其中孵育是一種非常簡單的方法，許多早期的載藥方案都采用這種方法，皂苷是溫和的表面活性劑，可引起膜的瞬時不穩(wěn)定，從而使藥物進入 EVs 中，但是后續(xù)需要去除多余的皂苷。脂質(zhì)體融合也是一種載藥的理想方法。(如圖5)含有融合性脂質(zhì)的脂質(zhì)體與 EVs 孵育，使二者發(fā)生融合，可以同時發(fā)揮兩種載藥平臺的優(yōu)勢，起到1+1>2 的效果。例如：2020 Advanced Science上發(fā)表的文章，在外泌體上表達 CD47 分子，使其具有免疫逃逸的功能。同時利用熱敏脂質(zhì)體裝載抗癌藥物，將兩者進行融合，用 NanoFCM 測定融合效率高達 95.7%。這種復(fù)合納米顆粒既能避免被機體免疫清除，同時又裝載了治療藥物，極大地提高了治療效果。
 

圖5. 外泌體-脂質(zhì)體融合流程
 

圖6. 不同載藥方法成本和效率對比
 

三、EVs純化方法和質(zhì)量監(jiān)控
對于EV分離，可以通過確定的生物分離程序，包括離心、深度過濾(機械篩分和吸附)和切向流(交叉流)過濾來完成細胞中產(chǎn)品的初步分離。EVs 分離的方法包括：微分超速離心(dUC)、沉淀、尺寸排阻色譜、親和層析、切向流過濾等，但是目前并沒有公認的適合于大規(guī)模生產(chǎn)的 EVs 分離技術(shù)。主要原因是某些程序可能會對 EVs 的完整性和質(zhì)量產(chǎn)生負面影響。同時，產(chǎn)量和產(chǎn)品純度會因為方法和報告的不同而不同，所以總體 EVs 純度一般都比較低。此外，對于異質(zhì)性 EVs 群體，分離方法可能導(dǎo)致生物活性高于或低于總?cè)后w的特定亞群被選擇性分離。
綜上，目前亟需對不同分離方法在 EVs 回收效率、純度、蛋白標志物、裝載藥物量等方面進行評價，制定統(tǒng)一的流程和標準。在2020年背靠背發(fā)表的兩篇 JEV 文章中( Liang Dong et al., 2020， Ye Tian et al., 2020)，作者分別對不同來源的 EVs 的純化方法進行了綜合比較，意在評估不同純化方法的優(yōu)缺點，從而促進 EVs 分離純化的標準和質(zhì)量監(jiān)控。其中 Liang Dong 等用 NanoFCM 對不同 EVs 分離方法進行對比，分析 EVs 大小、濃度、回收效率、純度、表面標志物等物理、生化性質(zhì)。不同的純化方法具有各自的優(yōu)勢和不足，研究人員應(yīng)根據(jù)樣品類型、下游分析和工作場景(如臨床或?qū)嶒炇?，在 EVs 回收率和純度之間尋找平衡，根據(jù)樣本的類型和體積，文中作者給出了相應(yīng)的方案供研究者參考(如圖7-圖8)。文章全文使用 NanoFCM 對不同樣品外泌體用不同純化方法純化進行了研究，NanoFCM 可在單顆粒水平對 EVs 的顆粒濃度、大小、純度、蛋白等進行表征，研究純化方法對EVs的影響，優(yōu)化 EVs 的純化過程，有望為建立標準有效的 EVs 分離和質(zhì)控方法提供表征手段。
 

圖7. EVs表面標志物蛋白分析
 

圖8. 不同來源EVs純化方法選擇

四、總結(jié)和展望
從監(jiān)管的角度來看，EVs 屬于生物制劑的制藥類別(根據(jù)不同地區(qū)的說法，分別被稱為生物藥物、生物制劑或生物制藥)，包含一種或多種由生物細胞制成或從生物細胞中提取的活性物質(zhì)。一般而言，生物制劑中的活性物質(zhì)要比非生物制劑中的活性物質(zhì)復(fù)雜。目前這種復(fù)雜的物質(zhì)和結(jié)構(gòu)只能由活的生物體產(chǎn)生。然而，這種生產(chǎn)方法本質(zhì)上面臨著一定程度的內(nèi)在生物變異，這可能導(dǎo)致不同批次間產(chǎn)品的異質(zhì)性。

從工藝設(shè)計的角度來看，這種異質(zhì)性既受到用于表達生物制劑的細胞內(nèi)生物工藝(上游加工)的影響，也受到用于生產(chǎn)生物制劑的制造工藝(下游加工)的影響。值得注意的是，培養(yǎng)條件：如細胞傳代、細胞密度和EVs 收獲頻率，極大地影響產(chǎn)品質(zhì)量，包括產(chǎn)量、EVs 組成和 EVs 的生物活性等。生產(chǎn)條件的微小變化可能會對EVs產(chǎn)品質(zhì)量和活性產(chǎn)生相當大的影響，所以這些細微條件的改進均需要一種在單顆粒水平，快速、高通量檢測的方法來進行質(zhì)量監(jiān)控。
納米流式檢測儀(NanoFCM)可在單顆粒水平，對 40-1000 nm的EVs進行單顆粒分析，測定 EVs 的顆粒濃度、粒徑分布、載藥量、蛋白、核酸等物理生化性質(zhì)，對 EVs 的生產(chǎn)過程進行質(zhì)量控制，優(yōu)化生產(chǎn)條件、提高載藥效率。同時可對 EVs 在生產(chǎn)后的穩(wěn)定性進行評價，評估不同存儲條件對 EVs 的影響，NanoFCM 的應(yīng)用貫穿整個藥物研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)控、穩(wěn)定性評估等整個過程，極大加快 EVs 藥物研發(fā)的進程！
¹EVOX發(fā)展了名為DeliverEXTM的外泌體遞送平臺，此平臺可以設(shè)計和修飾外泌體，并將蛋白、RNA及其他類型的藥物加載到外泌體中，使其具有靶向目標組織的功能，將藥物遞送到靶器官中。借助于DeliverEXTM平臺，EVOX在2020年分別與制藥巨頭武田和禮來達成了巨額的合作協(xié)議(分別為8.82億美元和12億美元)，將其外泌體技術(shù)應(yīng)用于遞送蛋白質(zhì)或RNA，從而實現(xiàn)罕見病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，維持制藥巨頭在各自領(lǐng)域的優(yōu)勢。