代謝組學(xué)資訊：利用代謝流與脂質(zhì)組手段探究肝癌細(xì)胞抗放療真相
文章標(biāo)題：Integration of Glucose and CardiolipinAnabolism Confers Radiation Resistance of Hepatocellular Carcinoma

發(fā)表期刊：HEPATOLOGY
發(fā)表時(shí)間：2021.9.24
影響因子：17.4
合作客戶：南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院
百趣生物提供服務(wù)：代謝組學(xué)代謝流檢測(cè)分析及脂質(zhì)組分析 

研究背景

肝細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有預(yù)后不佳的特點(diǎn)，而放射治療(RT)是少數(shù)幾種臨床可行的治療方法之一，但由于固有的或獲得性耐藥，其療效一直受到限制。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明，代謝重編程在幾種癌癥類(lèi)型中起到輻射抵抗的促進(jìn)作用。腫瘤代謝重新編程的中心組成部分之一是有氧糖酵解(也稱為Warburg效應(yīng))，其中間代謝產(chǎn)物葡萄糖可以被輸送到合成代謝途徑，如從頭合成脂肪、氨基酸合成和核苷酸合成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和進(jìn)展，抑制細(xì)胞凋亡。因此，葡萄糖經(jīng)常作為腫瘤其他代謝途徑的代謝基礎(chǔ)，然而，代謝變化產(chǎn)生的代謝物如何以及哪些代謝產(chǎn)物與電離輻射(IR)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)仍不清楚。在這里，作者通過(guò)比較不同肝癌細(xì)胞的代謝依賴性與固有或獲得性放射抵抗描繪了抑制細(xì)胞凋亡驅(qū)動(dòng)放射抵抗的綜合代謝機(jī)制，并提出了破壞輻射增敏的代謝依賴性的治療策略。

研究結(jié)果

01固有放射抵抗細(xì)胞系篩選與獲得性放射抵抗細(xì)胞系培養(yǎng)1
克隆形成分析顯示，隨著IR劑量的增加，肝癌細(xì)胞系的放射敏感性發(fā)生了變化(圖1A)。值得注意的是，QGY-7701是使用的抗性最強(qiáng)的品系。由于MHCC97H和MHCC97L細(xì)胞系對(duì)IR相對(duì)敏感且克隆能力較弱，作者將它們分別暴露在常規(guī)或次分級(jí)IR中，目的是在不同的分割方案下產(chǎn)生獲得性IR抗性(IR-R)亞系(圖1B)。并通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK8)試驗(yàn)、MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)、克隆形成存活試驗(yàn)和中性彗星試驗(yàn)(圖1C-E)確定了IR-R亞系的抗輻射狀態(tài)。
 

圖1. 肝癌細(xì)胞系對(duì)IR的響應(yīng)及耐輻射亞系的產(chǎn)生

02、葡萄糖代謝增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的放射抗性
為了探索抗輻射的分子機(jī)制，作者觀察到與MHCC97H對(duì)照組相比，MHCC97HIR-R抗輻射組中的多種代謝途徑在蛋白水平上顯著變化(圖2A)。隨后作者分別在葡萄糖、谷氨酰胺或血清剝奪條件下培養(yǎng)細(xì)胞，以檢測(cè)抗輻射細(xì)胞的能量來(lái)源；并以營(yíng)養(yǎng)豐富的條件作為對(duì)照。與最近表明葡萄糖代謝具有輻射防護(hù)作用的報(bào)告一致，只有剝奪葡萄糖會(huì)促進(jìn)IR-R細(xì)胞的死亡(圖2B)。由于大多數(shù)高度依賴葡萄糖的癌細(xì)胞在受到葡萄糖阻斷時(shí)往往會(huì)被迫發(fā)生凋亡，因此可以發(fā)現(xiàn)抗輻射細(xì)胞在低糖條件下表現(xiàn)出顯著的凋亡和存活率降低(圖2C)。IR-R細(xì)胞表現(xiàn)出比它們的親代對(duì)照細(xì)胞更高的葡萄糖攝取量，并且在低氧條件下差異更大(圖2D)。同時(shí)參與葡萄糖代謝的酶，如HK2、GLUT1、SLC2A1和PFKL，在IR-R細(xì)胞中的表達(dá)也增加；IR和低糖培養(yǎng)條件的結(jié)合協(xié)同導(dǎo)致IR-R細(xì)胞中克隆形成的存活率大大降低，但在親代細(xì)胞中則沒(méi)有發(fā)生這種現(xiàn)象(圖2E，F(xiàn))。總而言之，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了抗輻射的肝細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的依賴性增加。
 

圖2. 葡萄糖代謝增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞對(duì)放射的抵抗能力

03、葡萄糖對(duì)心磷脂合成的增強(qiáng)促進(jìn)了放射抵抗肝癌細(xì)胞細(xì)胞色素c的釋放
為了進(jìn)一步明確葡萄糖在親本細(xì)胞和抗輻射細(xì)胞中的流向變化，進(jìn)而探究葡萄糖是通過(guò)怎樣的代謝重編譯來(lái)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)放射的抵抗能力，作者進(jìn)行了U-13C葡萄糖示蹤的代謝流質(zhì)譜分析。通過(guò)代謝流實(shí)驗(yàn)作者發(fā)現(xiàn)，在MHCC97H細(xì)胞中，葡萄糖流向主流糖酵解代謝產(chǎn)物和三羧酸(TCA)循環(huán)衍生代謝物的速度比IR-R細(xì)胞快，而在IR-R細(xì)胞中，葡萄糖流向分支代謝物(如絲氨酸和甘氨酸)的流量增加。結(jié)合相關(guān)蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)和IR-R細(xì)胞中較高的HK2活性但較低的乳酸含量，作者推測(cè)IR-R細(xì)胞可能通過(guò)靈活組裝分配糖酵解的中間代謝物以增強(qiáng)分支合成代謝來(lái)對(duì)抗輻射(圖3A)。通過(guò)非靶代謝組的實(shí)驗(yàn)作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)甘油磷脂（GPL）的代謝通路發(fā)生了顯著的變化(圖3B)。而因?yàn)镚PL的合成需要依賴于游離脂肪酸和甘油-3-磷酸，甘油-3-磷酸又來(lái)源于脫氫二羥丙酮磷酸(DHAP)，所以GPL的合成正好將葡萄糖代謝與脂代謝所串聯(lián)在一起。而在各種GPL中，心磷脂(CLS)是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的磷脂，僅在線粒體中合成。早期研究表明，CL水平的增加可以加強(qiáng)細(xì)胞色素c的膜結(jié)合，從而使細(xì)胞在受到凋亡刺激時(shí)更有可能存活。由于細(xì)胞色素c介導(dǎo)的凋亡是IR引起的主要死亡方式之一，為了探究CL合成是否與輻射抵抗有關(guān)。作者首先進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)研究，以確定MHCC97H親本細(xì)胞和IR-R細(xì)胞中脂質(zhì)譜的整體變化。結(jié)果表明，IR-R細(xì)胞內(nèi)顯著積聚的脂質(zhì)主要由GPLs組成。更重要的是，與親本細(xì)胞相比，IR-R細(xì)胞中磷脂酰甘油(PG；CL合成酶1[CRLS1]消耗的脂類(lèi))的種類(lèi)減少，而CL合成的種類(lèi)增加，這意味著CL合成的增強(qiáng)(圖3C)。
 

圖3. 代謝組揭示了抗輻射肝癌細(xì)胞中葡萄糖向CL合成代謝流量的增加

為了研究細(xì)胞色素c的潛在作用。作者隨后使用了抑制細(xì)胞色素c釋放的小分子鹽酸二甲胺四環(huán)素(M-HCl)來(lái)處理細(xì)胞。通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)到IR后親代細(xì)胞中細(xì)胞色素c的在胞漿中增加了，M-HCl處理顯著恢復(fù)了IR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而在IR-R和QGY-7701細(xì)胞中沒(méi)有觀察到這種變化或恢復(fù)作用，表明細(xì)胞色素c的釋放在一定程度上被阻止在輻射抵抗的肝癌細(xì)胞中(圖4A)。為了進(jìn)一步確定該塊是否依賴CLs，我們針對(duì)CRLS1產(chǎn)生了小干擾(si-)RNA來(lái)預(yù)處理抗輻射細(xì)胞。結(jié)果表明，在被試細(xì)胞中抑制CRLS1可以相應(yīng)地促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，降低細(xì)胞CL含量，并在IR處理時(shí)顯著增加細(xì)胞死亡(圖4B)。總而言之，這些數(shù)據(jù)表明，葡萄糖和CL合成代謝的整合通過(guò)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中細(xì)胞色素c的分泌來(lái)調(diào)節(jié)輻射抗性。
 

圖4.HIF-1α和SREBP1介導(dǎo)的葡萄糖到CL合成代謝的增加抑制了抗輻射

04、mTORC_1通過(guò)促進(jìn)HIF-1α和SREBP_1的翻譯介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的輻射抗性
1根據(jù)前文的數(shù)據(jù)顯示，低氧進(jìn)一步擴(kuò)大了IR-R和親本細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收差異（圖2D），同時(shí)IR-R細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的信號(hào)增加。為了探究抗輻射細(xì)胞的葡萄糖依賴是否受HIF-1α調(diào)控。當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控葡萄糖合成代謝時(shí)，HIF-1α會(huì)使mTORC1信號(hào)的激活，mTORC1信號(hào)是刺激類(lèi)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)調(diào)節(jié)脂肪生成所必需的。

作者接下來(lái)構(gòu)建了HIF-1α和SREBP1下調(diào)的抗輻射肝癌細(xì)胞系。結(jié)果表明，具有HIF-1α或SREBP1基因敲除的耐藥細(xì)胞分別抑制了參與葡萄糖代謝或CL合成的下游代謝靶點(diǎn)(圖4C)。在功能上，抑制HIF-1α或SREBP1可顯著降低放射抗性，減少細(xì)胞CL含量，并加速I(mǎi)R誘導(dǎo)的耐藥肝癌細(xì)胞細(xì)胞色素c的釋放(圖4D)。隨后作者通過(guò)對(duì)HIF-1α或SREBP1多聚體的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，mTORC_1并非是在轉(zhuǎn)錄水平，而是在轉(zhuǎn)錄后翻譯階段介導(dǎo)了肝癌細(xì)胞的輻射抗性。

研究小結(jié)

綜上所述，該研究破譯了葡萄糖和CL合成代謝的整合，由mTORC1HIF-1α/SREBP1信號(hào)調(diào)節(jié)，通過(guò)抑制獲得性和內(nèi)在放射抵抗的肝癌細(xì)胞中細(xì)胞色素c的釋放來(lái)介導(dǎo)輻射抵抗(圖5)。隨著RT在肝癌治療中的逐步興起，了解這種代謝性腫瘤的代謝脆弱性并闡明其潛在的機(jī)制可能有助于確定對(duì)肝癌患者進(jìn)行更有效的綜合治療。

圖5. 工作模型描述了驅(qū)動(dòng)葡萄糖和CL合成代謝的機(jī)制。

FFA，游離脂肪酸；F6P，果糖-6-磷酸；F1，6P，果糖-1，6-二磷酸；G6P，葡萄糖-6-磷酸；IHC，免疫組織化學(xué)；ROS，活性氧

科研延伸
BIOTREE靶向代謝流分析通過(guò)領(lǐng)先的技術(shù)手段對(duì)三羧酸循環(huán)（TCA） 糖酵解途徑（EMP） 戊糖磷酸途徑（PPP）三大主要能量代謝途徑上共計(jì)50+關(guān)鍵代謝物進(jìn)行高通量靶向代謝組學(xué)檢測(cè)，高效準(zhǔn)確的確定樣本中代謝物的變化，隨后采用針對(duì)代謝流開(kāi)發(fā)的算法分析代謝物的流向與流量變化，極大地豐富了數(shù)據(jù)挖掘的深度。

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文/阿趣代謝組學(xué)