自2017年第一款CAR-T藥物Kymriah被FDA批準(zhǔn)以后，目前全球共有8款CAR-T 藥物上市，并且全球的研發(fā)管線中，除了CAR-T以外，其他T細(xì)胞療法（TCR-T、TIL、NKT、TAA-targeted T）及其他細(xì)胞療法（NK、 DC、干細(xì)胞、髓系細(xì)胞）均有大幅增長。很多科學(xué)家預(yù)言，細(xì)胞治療將成為未來腫瘤治療的重要手段。

 

細(xì)胞治療作為一種新興的治療手段，還有很多問題和挑戰(zhàn)有待科學(xué)家及研發(fā)學(xué)者們解決，例如靶向?qū)嶓w瘤的有效性、復(fù)雜性細(xì)胞療法的制備和臨床實(shí)施障礙等。本文就CAR-T細(xì)胞的臨床前體內(nèi)試驗(yàn)這一環(huán)節(jié)，將講述如何選擇更優(yōu)的動(dòng)物模型，提高臨床轉(zhuǎn)化率。因?yàn)楹线m的臨床前藥效研究模型，可以加速免疫藥物研發(fā)和開發(fā)新型組合療法的進(jìn)程，最大程度減少臨床試驗(yàn)失敗風(fēng)險(xiǎn)。

 

1.提及細(xì)胞治療時(shí)， 我們首先選用什么動(dòng)物模型呢？

選擇合適的動(dòng)物模型可用于CAR-T細(xì)胞功能的概念驗(yàn)證。但由于物種差異，在動(dòng)物模型內(nèi)會(huì)存在CAR-T細(xì)胞和腫瘤靶點(diǎn)的物種特異性、異種移植物抗宿主反應(yīng)、在動(dòng)物中模擬人類免疫反應(yīng)困難等問題，沒有一種完美的模型可以完全模擬臨床上的反應(yīng)。

 

但在人源化小鼠模型（在這里指人類腫瘤異種移植小鼠模型）中進(jìn)行的體內(nèi)試驗(yàn)可以提供有關(guān)CAR-T細(xì)胞藥效、分布和增殖特征的信息。并且在這些人源化小鼠模型上進(jìn)行的臨床前測試和評估已經(jīng)成為驗(yàn)證這些細(xì)胞療法的黃金標(biāo)準(zhǔn)，并獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。

2022年3月15日，F(xiàn)DA頒布《Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products》草案

 

這里的人源化模型，最廣泛使用的是超重度免疫缺陷NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse/ (NOG/NSG)小鼠，原因是什么呢？

• NOG小鼠缺乏小鼠T、B、NK和功能性樹突狀細(xì)胞，更容易接受人類腫瘤細(xì)胞系、腫瘤組織和健康組織的移植。
• CAR-T等人源T細(xì)胞，在NOG小鼠上被動(dòng)物排斥較小，可進(jìn)行CAR-T等細(xì)胞藥物的有效評估。其他模型由于免疫系統(tǒng)的存在，會(huì)對人源細(xì)胞治療藥物進(jìn)行排斥。這是細(xì)胞治療需要選用超重度免疫缺陷鼠NOG非常重要的原因。
• NOG小鼠可支持人類造血干細(xì)胞的移植及免疫細(xì)胞的發(fā)育。
• NOG/NSG的異種移植模型已經(jīng)為研究人類免疫系統(tǒng)和血液瘤之間相互作用的平臺(tái)，尤其是血液瘤的PDX移植，可以同時(shí)將人的免疫細(xì)胞植入，比較好地模擬了腫瘤細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境(例如，免疫細(xì)胞)在體內(nèi)的呈現(xiàn)。

 

Humanized Mice Are Precious Tools for Preclinical Evaluation of CAR T and CAR NK Cell Therapies

    

Preclinical modeling of CAR T Cell therapy in humanized cancer mice models.(A) Different humanized mice models for preclinical modeling of different malignancies.(B) The relevant preclinical data for CAR T cell treatment obtained for the indications in (A).

 

慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)是成人最常見的白血病，一些患者接受CAR-T治療后能夠得到緩解，但很多患者由于T細(xì)胞衰老，療效有限。

 

2022年Funk CR等的最新研究表明，CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加雙pi3k δ/γ抑制劑duvelisib可以增加干細(xì)胞記憶性CD8+ CART細(xì)胞的產(chǎn)量，改變表觀遺傳修飾：CD4/CD8比值標(biāo)準(zhǔn)化、線粒體質(zhì)量增加。賦予CD28和41BB CAR-T在NOG小鼠體內(nèi)更大的體內(nèi)擴(kuò)張和抗腫瘤活性

https://ashpublications.org/blood/article/139/4/523/476855/PI3K-inhibition-promotes-human-CART-cell

 

2.特殊情況下的更優(yōu)模型選擇

雖然NOG小鼠為細(xì)胞治療的臨床前功能藥效提供了重要的數(shù)據(jù)支撐，但隨著細(xì)胞治療研究的深入及擴(kuò)展，一些情況下需要新一代的NOG模型，才能更好地支持研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

• 降低GvHD風(fēng)險(xiǎn)，長期的T細(xì)胞治療藥效評估
• 臨床前T細(xì)胞治療實(shí)體瘤，如何更貼近臨床？
• NK細(xì)胞治療如何擺脫臨床前在小鼠體內(nèi)無法發(fā)揮藥效的困境？

 

這些情況下應(yīng)該選擇哪種更優(yōu)的模型？我們一起來分析一下吧

 

雖然NOG小鼠在細(xì)胞治療的臨床前功能藥效驗(yàn)證了發(fā)揮了非常重要的作用，但越來越多的研發(fā)學(xué)者發(fā)現(xiàn)將人成熟T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到NOG小鼠，會(huì)導(dǎo)致移植物抗宿主病(GvHD)，這非常不利于CAR - T細(xì)胞治療的長期藥效評估。

Xeno-GvHD異種移植發(fā)生有以下三個(gè)先決條件

• 移植的T細(xì)胞有免疫活性
• 宿主對移植物來說是異己
• 宿主無力對移植物發(fā)動(dòng)有效免疫攻勢

 

人源PBMC或者CAR-T等來源的T細(xì)胞移植到NOG小鼠中，符合以上三個(gè)先決條件，導(dǎo)致GvHD會(huì)不可避免的發(fā)生。當(dāng)然GvHD的嚴(yán)重程度也跟CAR-T細(xì)胞來源的donor，CAR設(shè)計(jì)的特異性，注射劑量等有關(guān)。

 

如何降低臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由于物種差異，而導(dǎo)致的這種異源T細(xì)胞移植引起的Xeno-GvHD呢？如何更好地進(jìn)行T細(xì)胞藥物評估呢？

NOG-MHC I/II-2 KO（NOG-dKO）小鼠是首選推薦的臨床前動(dòng)物模型。NOG-dKO小鼠敲除了小鼠的MHC I/II 分子，使得移植的T細(xì)胞無法對小鼠識別，從而無法進(jìn)行免疫攻擊，大大減緩了GvHD, 為研發(fā)者提供了充足的研發(fā)周期。

 

由于CAR-T自體治療的局限性，科學(xué)家們越來越傾向于選擇異體來源T細(xì)胞，其中誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞iPSCs是一重要來源。

 

2021年日本京都大學(xué)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞研究中心（Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University）的研究結(jié)果表明：經(jīng)基因改造的低免疫原性iPSC衍生的T細(xì)胞可能有助于現(xiàn)成的T細(xì)胞免疫療法的產(chǎn)生。同時(shí)表明NOG-dKO(MHC-I- and MHC-II-knockout NOG)小鼠減少異種GvHD反應(yīng)，這將增加iPS-T細(xì)胞的觀察時(shí)間，并且能為iPS-T細(xì)胞治療提供更準(zhǔn)確的臨床預(yù)測。

ang, B., Iriguchi, S., Waseda, M. et al. Generation of hypoimmunogenic T cells from genetically engineered allogeneic human induced pluripotent stem cells. Nat Biomed Eng 5, 429–440 (2021). https://doi.org/10.1038/s41551-021-00730-z

 

NOG-dKO小鼠的額外優(yōu)勢

利用NOG-dKO小鼠除了解決了部分CAR-T細(xì)胞療法中窗口期短的問題，對CAR-T細(xì)胞因子風(fēng)暴評估的準(zhǔn)確及合理性也有重要的作用。

 

CAR-T細(xì)胞療法顯著的副作用之一就是可能會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴，需要在臨床前進(jìn)行合理的評估。臨床上腫瘤患者接受CAR-T細(xì)胞療法后，會(huì)出現(xiàn)CAR-T細(xì)胞的增殖，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子釋放增多的現(xiàn)象，但隨著腫瘤的消退，CAR-T細(xì)胞量及細(xì)胞因子釋放量都會(huì)減少。但臨床前在基礎(chǔ)的NOG小鼠上，由于CAR-T細(xì)胞移植后Xeno-GvHD的產(chǎn)生，會(huì)導(dǎo)致非特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增，隨著腫瘤的消退，細(xì)胞因子釋放量也不會(huì)減少，與臨床上的差異較大。

 

NOG-dKO小鼠由于消除了Xeno-GvHD, 除了更準(zhǔn)確地評估T細(xì)胞治療藥物的藥效外，對細(xì)胞因子的釋放也可做初步的評估。目前已有一些CAR-T研發(fā)者傾向于使用NOG-dKO小鼠，除了可以滿足長期的藥效評估，同時(shí)還可進(jìn)行細(xì)胞因子釋放的評估。

 

CAR-T/TCR-T/TIL等治療實(shí)體瘤的臨床前“重要發(fā)現(xiàn)”：

2017 年，Dr. Jonas Nilsson 的研究發(fā)現(xiàn)，ACT 的抗腫瘤活性與細(xì)胞因子 IL-2 有關(guān)，hIL-2 NOG 自體腫瘤模型有助于重現(xiàn)患者對治療的反應(yīng)，而NOG小鼠無法重現(xiàn)。

 

2019 年，Elin Forsberg 的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在 hIL-2 NOG 小鼠可觀察到 HER2 CAR-T 治療實(shí)體黑色素瘤的體內(nèi)療效 , 且這種功效僅在 hIL-2 NOG 模型中可見，而在基礎(chǔ)的 NOG小鼠中并未出現(xiàn)。目前越來越多的研究表明，hIL-2 NOG 小鼠是評估臨床前T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的重要模型。

 

NOG小鼠在血液瘤中可以很好地評估T細(xì)胞治療效果。但在一些實(shí)體瘤中，由于小鼠中缺少人源的細(xì)胞因子IL-2等，復(fù)雜的腫瘤免疫微環(huán)境導(dǎo)致T細(xì)胞無法浸入，使得T細(xì)胞療法無法在臨床前得到有效評估。hIL-2 NOG小鼠中人源IL-2細(xì)胞因子的持續(xù)表達(dá)，將有利于更好地貼近臨床患者的情況，得到更準(zhǔn)確的臨床預(yù)測。

 

2022AACR會(huì)議上，Lovance Biotherapeutics報(bào)道了一款基因修飾的TL細(xì)胞治療(PDCD-1KO)的臨床前體內(nèi)治療效果：

 

利用hIL-2 NOG小鼠，發(fā)現(xiàn)PDCD-1 KO TIL的治療效果遠(yuǎn)高于MOCK TIL和PD-1聯(lián)合給藥組。表明了內(nèi)源性的敲除PDCD-1將在TIL治療中發(fā)揮非常重要的作用。這些結(jié)果表明PDCD-1 KO TIL（IOV-4001）是一種治療實(shí)體瘤的非常有潛力的臨床選擇，該項(xiàng)成果即將在黑色素瘤及非小細(xì)胞肺癌中開展臨床研究。

Preclinical Activity And Manufacturing Feasibility of Genetically Modified PDCD-1 Knockout(KO) Tumor-infiltrating Lymphocyte(TIL) Cell Thetapy.

 

提到NK細(xì)胞治療，我們要清楚NK細(xì)胞與T細(xì)胞的增殖差異。NK細(xì)胞擴(kuò)增需要通過白介素等外界因子的刺激作用，才能促使NK細(xì)胞自我復(fù)制和增殖。

 

日本CIEA的研究數(shù)據(jù)表明，將人源的NK細(xì)胞直接移植到NOG小鼠中，移植后1-2周，在外周血中已檢測不到人源NK細(xì)胞。而在hIL-15 NOG小鼠中，人源NK細(xì)胞移植后，NK細(xì)胞可維持12周以上，絕對數(shù)量在移植后4-5周左右達(dá)到峰值。

 

故臨床前NK細(xì)胞治療的藥效評估，如果缺少人源細(xì)胞因子，NK細(xì)胞則無法發(fā)揮藥效。hIL-15 NOG小鼠可持續(xù)表達(dá)人源細(xì)胞因子IL-15, 有利于動(dòng)物體內(nèi)人源NK的增殖及維持，從而進(jìn)一步發(fā)揮抗腫瘤藥效。

 

3.總結(jié)

NOG小鼠的超重度免疫缺陷特性，為細(xì)胞治療的臨床前藥理藥效及毒理評估提供了非常重要的數(shù)據(jù)支撐。但針對不同的細(xì)胞治療、不同的癌種適應(yīng)癥及研發(fā)者不同的關(guān)注點(diǎn)等，我們需要根據(jù)實(shí)際情況選用不同的新一代NOG小鼠，以更好地模擬臨床患者情況，提高準(zhǔn)確性。

 

本文重點(diǎn)關(guān)注了細(xì)胞治療中藥理藥效的動(dòng)物模型選擇，在動(dòng)物模型中的臨床前安全性評估同樣不可忽視。NOG小鼠由于超重度免疫特性，可以為這些細(xì)胞治療的致瘤性風(fēng)險(xiǎn)提供非常好的安全性評價(jià)。

NOG小鼠作為超重度免疫缺陷鼠，對細(xì)胞致瘤性非常敏感，且自發(fā)性腫瘤率極低，壽命長，是致瘤性安全測試的較好模型。日本NIHS（National Institute of Health Sciences ）的研究結(jié)果表明，NOG小鼠是hiPSCs細(xì)胞藥物致瘤性測試的優(yōu)選模型。

 

NOG及新一代NOG小鼠盡管可以提供一些簡單的藥物毒性分析，但由于缺乏人源免疫系統(tǒng)，CAR-T無法模擬CRS在這些免疫缺陷小鼠中引起的級聯(lián)反應(yīng)，這些現(xiàn)象在臨床患者中卻可能會(huì)發(fā)生；另外，在這些模型中也無法評估CAR-T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞/組織之間的相互作用。目前沒有一個(gè)完美的模型可以用來評估這些新興細(xì)胞治療的安全性，但有研究表明，免疫系統(tǒng)重建的人源化小鼠是目前預(yù)測神經(jīng)毒性、細(xì)胞因子風(fēng)暴評估、CAR-T對局部組織的影響和巨噬細(xì)胞激活綜合征(MAS)的最佳臨床前研究系統(tǒng)。