iTRAQ/TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組在非小細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移機(jī)制新解研究中的應(yīng)用
百趣生物iTRAQ/TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組研究是對(duì)一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜混
體系內(nèi)所有蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，利用標(biāo)記試劑中的二級(jí)報(bào)告離子來對(duì)蛋白進(jìn)行精確鑒定和定量。接下來就跟著阿趣一起解讀吧。
體系內(nèi)所有蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，利用標(biāo)記試劑中的二級(jí)報(bào)告離子來對(duì)蛋白進(jìn)行精確鑒定和定量。接下來就跟著阿趣一起解讀吧。
文章標(biāo)題：Profilin 1 Induces Tumor Metastasis byPromoting Microvesicle Secretion Through the ROCK 1/p-MLC Pathway in Non-SmallCell Lung Cancer
發(fā)表期刊：Frontiers in Pharmacology
發(fā)表時(shí)間：2022.5
影響因子：5.988
合作單位：中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
百趣生物提供服務(wù)：TMT標(biāo)記蛋白組
01摘要
Profilin 1(PFN1)是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在幾種癌癥的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著不同的作用；然而，其在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)轉(zhuǎn)移中的作用仍不清楚。作者應(yīng)用TMT標(biāo)記定量蛋白組技術(shù)研究其誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示PFN1參與微泡(MV)分泌。與非轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的血清相比，轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的血清中MV的豐度增加。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明，PFN1可以增加MV分泌，并且源自PFN1過表達(dá)細(xì)胞的MV顯著促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移。同樣發(fā)現(xiàn)PFN1可以與ROCK1相互作用并增強(qiáng)其激酶活性以促進(jìn)肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化從而促進(jìn)MV分泌。ROCK1的抑制降低了MV的分泌并部分逆轉(zhuǎn)了PFN1誘導(dǎo)的NSCLC轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明PFN1調(diào)節(jié)MV分泌以促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移。PFN1和MV代表了NSCLC轉(zhuǎn)移的潛在預(yù)測因子或治療靶點(diǎn)。
02實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.PFN1與NSCLC 轉(zhuǎn)移相關(guān)，可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞體外遷移
為了研究PFN1在NSCLC中的作用，作者采用IHC方法、組織芯片定量等實(shí)驗(yàn)，表明了PFN1參與了NSCLC的轉(zhuǎn)移，并構(gòu)建細(xì)胞系，通過RT-qPCR和Western檢測過表達(dá)和敲除的影響，后又采用傷口愈合和Transwell遷移試驗(yàn)來確定PFN1對(duì)遷移的影響。
圖1. NSCLC組織PFN1的IHC分析圖像/Kaplan–Meier生存分析
2.PFN1可促進(jìn)NSCLC中Mv的分泌
為了進(jìn)一步研究EV和PFN1 OE細(xì)胞之間的分子差異以及影響NSCLC的可能信號(hào)通路。作者利用基于蛋白質(zhì)組學(xué)的方法（TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)）描述它們之間的蛋白質(zhì)水平。差異蛋白質(zhì)（DEPs）篩選條件為P值<0.05和倍數(shù)變化≤0.83或倍數(shù)變化≥1.2。結(jié)果確定了581個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中327個(gè)上調(diào)的蛋白質(zhì)和254個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)（圖2）。
圖2. 差異表達(dá)蛋白分析熱圖
接下來，利用富集分析來確定這些DEPs是否可以指向任何特定的生物學(xué)功能，從而可以深入了解它們?cè)谏飳W(xué)功能上的差異。GO注釋表明DEPs涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生和細(xì)胞器組織（圖3）。大多數(shù)不同表達(dá)的蛋白與細(xì)胞器相關(guān)，這與PFN1在細(xì)胞膜運(yùn)輸中的作用相一致。同源蛋白群簇(COG/KOG)分析顯示，DEPs參與了翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（圖4）。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，我們推斷PFN1可能通過蛋白相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與細(xì)胞外囊泡分泌，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移。
圖3. 差異表達(dá)蛋白的GO富集分析
圖4. 差異表達(dá)蛋白的COG／KOG分析
由于PFN1在細(xì)胞膜運(yùn)輸中起著重要作用，而MVs是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)，我們從臨床樣本的血清中提取了細(xì)胞外囊泡(MVs和外泌體)。通過一系列實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PFN1可能調(diào)控MLC的磷酸化，而磷酸化可以調(diào)節(jié)MV的分泌。
3.來自PFN1OE細(xì)胞的MVs促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的遷移
Mv是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)。作者收集了轉(zhuǎn)移性（n=25）和非轉(zhuǎn)移性（n=20）肺癌患者的血清樣本，并提取了Mv（圖5）。作者通過一系列過表達(dá)，以及傷口愈合和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PFN1可能通過誘導(dǎo)MV分泌促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移。
圖5. 為確定PFN1在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用而建立的轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型示意圖
4.PFN1通過提高M(jìn)V的分泌來促進(jìn)體內(nèi)NSCLC的轉(zhuǎn)移
為了進(jìn)一步研究PFN1在NSCLC轉(zhuǎn)移中的作用，我們通過心內(nèi)注射H1299NSCLC細(xì)胞建立了腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠模型，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PFN1在NSCLC轉(zhuǎn)移中的作用（圖6）。
為了進(jìn)一步研究PFN1在NSCLC轉(zhuǎn)移中的作用，我們通過心內(nèi)注射H1299NSCLC細(xì)胞建立了腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠模型，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PFN1在NSCLC轉(zhuǎn)移中的作用（圖6）。
圖6. HE染色小鼠模型肺組織的代表性圖像/肺組織中PFN1和p-MLC表達(dá)
5.PFN1促進(jìn)MLC磷酸化的機(jī)制
作者通過敲低、過表達(dá)、co-IP、Western blot、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PFN1可以與ROCK1相互作用，增強(qiáng)其激酶活性，并間接促進(jìn)MLC磷酸化，最終誘導(dǎo)MV分泌。ROCK1抑制劑Y27632部分逆轉(zhuǎn)了PFN1促進(jìn)MLC磷酸化和MV分泌的作用（圖7）。
作者通過敲低、過表達(dá)、co-IP、Western blot、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PFN1可以與ROCK1相互作用，增強(qiáng)其激酶活性，并間接促進(jìn)MLC磷酸化，最終誘導(dǎo)MV分泌。ROCK1抑制劑Y27632部分逆轉(zhuǎn)了PFN1促進(jìn)MLC磷酸化和MV分泌的作用（圖7）。
圖7. western印跡法測定PFN1過度表達(dá)(A)/敲除(B)后的蛋白表達(dá)/PF
6.ROCK1抑制劑Y27632在體內(nèi)和體外均部分逆轉(zhuǎn)了PFN1對(duì)NSCLC轉(zhuǎn)移的影響
創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)顯示（圖8），Y27632處理的過表達(dá)PFN1的細(xì)胞遷移減少到接近EV細(xì)胞.接下來，將過表達(dá)PFN1的細(xì)胞來源的MVs添加到y(tǒng)27632處理的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Y27632并沒有逆轉(zhuǎn)過表達(dá)PFN1的細(xì)胞來源的MVs誘導(dǎo)的遷移，從Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)果，此外也用小鼠模型驗(yàn)證了這些結(jié)果。
創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)顯示（圖8），Y27632處理的過表達(dá)PFN1的細(xì)胞遷移減少到接近EV細(xì)胞.接下來，將過表達(dá)PFN1的細(xì)胞來源的MVs添加到y(tǒng)27632處理的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Y27632并沒有逆轉(zhuǎn)過表達(dá)PFN1的細(xì)胞來源的MVs誘導(dǎo)的遷移，從Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)果，此外也用小鼠模型驗(yàn)證了這些結(jié)果。
圖8. 傷口愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估Y27632的療效
03總結(jié)
研究結(jié)果表明，PFN1是關(guān)鍵的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的關(guān)鍵蛋白之一，它通過ROCK/p-MLC通路促進(jìn)MV的釋放，從而促進(jìn)NSCLC的轉(zhuǎn)移。因此，PFN1可能是NSCLC轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)。通過減少M(fèi)Vs的釋放，有可能會(huì)部分逆轉(zhuǎn)PFN1過表達(dá)誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞遷移。本研究為靶向轉(zhuǎn)移治療NSCLC提供了一種潛在的新方法，值得進(jìn)一步研究。
2022已過半，在這過去的半年里，BIOTREE協(xié)助客戶在代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和多組學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域取得了驕人的成績。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截至目前百趣成功助力發(fā)表文章100+篇，平均IF為9.35，最高IF=46.297，其中5分以上的就有62篇，在數(shù)量和質(zhì)量上均創(chuàng)造了歷史高點(diǎn)！在這些研究中，百趣生物為研究者提供了發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)、GC-MS非靶標(biāo)代謝組學(xué)、600MRM、蛋白質(zhì)組學(xué)、中藥非靶標(biāo)代謝組學(xué)、植物MRM阿趣廣靶®代謝組學(xué)、靶標(biāo)代謝流、宏病毒組等服務(wù)。
文/阿趣代謝組學(xué)
標(biāo)簽：
蛋白組學(xué)
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