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文獻(xiàn)精讀第27期
 

文章概述
軸突再生和神經(jīng)功能恢復(fù)在老年人群中極為有限。因此，老年人的神經(jīng)系統(tǒng)損傷通常會導(dǎo)致嚴(yán)重且長期的殘疾。衰老能夠引起細(xì)胞信號傳導(dǎo)的廣泛變化，包括代謝、免疫和整體組織穩(wěn)態(tài)的變化，在神經(jīng)系統(tǒng)生理學(xué)和對損傷的反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。目前，我們對衰老依賴的再生失敗的分子機(jī)制的理解仍然很差，嚴(yán)重阻礙了神經(jīng)修復(fù)療法的發(fā)展，因此，迫切需要確定老化導(dǎo)致再生失敗的關(guān)鍵分子和細(xì)胞機(jī)制。2022年5月13日，英國帝國理工大學(xué)的研究人員在《Science》雜志上發(fā)表題為“Reversible CD8 T cell neuron cross-talk causes aging-dependent neuronal regenerative decline”的文章，該研究發(fā)現(xiàn)了一種衰老依賴的軸突再生衰退的細(xì)胞分子機(jī)制，依賴于趨化因子CXCL13進(jìn)行募集和激活的CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞，在與受損后過表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類（Major Histocompatibility Complex Ⅰ, MHC Ⅰ）的DRG神經(jīng)元交流后，會限制軸突再生。此外，作者利用人源化單克隆抗體對CXCL13的拮抗作用，成功逆轉(zhuǎn)衰老小鼠的神經(jīng)再生衰退并促進(jìn)了神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)，這些結(jié)果揭示了一種可用于未來治療的潛在途徑。
 

核心觀點(diǎn)
1、衰老與小鼠SNI損傷后DRG中T細(xì)胞活化信號的顯著升高有關(guān)，這些淋巴活化信號激活了轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，誘導(dǎo)神經(jīng)元表達(dá)趨化因子CXCL13；
2、SNI損傷后，DRG中受損神經(jīng)元分泌的CXCL13能夠募集CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞向受損后過表達(dá)MHC Ⅰ的神經(jīng)元附近遷移；
3、CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞與過表達(dá)MHC I的神經(jīng)元交流激活了Caspase-3，從而損害了pAKT和pS6信號，導(dǎo)致軸突再生失�。�
4、通過藥理學(xué)手段拮抗Caspase-3信號的激活，逆轉(zhuǎn)了老齡動物的軸突再生失敗，并恢復(fù)了pAKT和pS6的表達(dá)；
5、中和CXCL13可阻止CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞的募集，逆轉(zhuǎn)了衰老依賴的神經(jīng)再生能力衰退，從而促進(jìn)SNI后的神經(jīng)功能恢復(fù)。

研究結(jié)果分析
1. 衰老導(dǎo)致DRG穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)損傷后適應(yīng)性免疫基因譜出現(xiàn)廣泛變化
在坐骨神經(jīng)損傷（Sciatic Nerve Injury, SNI）之前（假手術(shù)）或之后（SNI），分別對8~10周齡（年輕）和20~22月齡（老年）小鼠的DRG進(jìn)行RNA-seq檢測。與年輕假手術(shù)小鼠相比，年輕的SNI小鼠DRG中觀察到的神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、G蛋白偶聯(lián)信號和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等基因表達(dá)下調(diào)，而在老年的SNI小鼠中未觀察到。衰老的DRG中適應(yīng)性免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)顯著富集，特別是在SNI后，T細(xì)胞和細(xì)胞因子/趨化因子信號顯著升高。
 

2. 在衰老DRG中，神經(jīng)元CXCL13和CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞顯著升高
CXCL13是SNI后上調(diào)最顯著的基因。在衰老的DRG中，CXCL13受體CXCR5的表達(dá)也顯著增強(qiáng)，提示存在CXCL13-CXCR5信號軸。當(dāng)衰老的DRG神經(jīng)元的再生減少時，CXCL13的表達(dá)在SNI損傷前和損傷3天后均顯著增加。盡管CXCL13在坐骨神經(jīng)損傷部位也有表達(dá)，但是并未觀察到衰老相關(guān)的變化。在SNI損傷后的第3天，衰老DRG中的CXCL13蛋白水平相對于年輕DRG也有顯著增加。
 

由于CXCL13是CXCR5⁺ B細(xì)胞和T細(xì)胞的趨化因子，研究者接下來評估了SNI后3天內(nèi)年輕或老年小鼠DRG中B細(xì)胞和T細(xì)胞的定位和免疫表型。衰老DRG中的CXCR5⁺ B細(xì)胞、CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞、以及CD4⁺ T細(xì)胞明顯增多。相當(dāng)比例的CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞為CD44⁺ CD69⁺ CD62L^-，提示它們是效應(yīng)記憶性T細(xì)胞，而只有一個非常少的CD8⁺ T細(xì)胞或CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞為CD103⁺和P2RX7⁺，表明這些細(xì)胞是遷移表型而非組織駐留表型。大約一半的CD8⁺和CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞也表達(dá)CXCR6，表明這些細(xì)胞具有滯留和有限再循環(huán)的能力。

老年小鼠血液中初始T細(xì)胞的總百分率降低，而記憶性CXCR5⁺ T細(xì)胞的百分率顯著升高。CD8⁺ T細(xì)胞的數(shù)量，包括CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞，再衰老DRG中顯著增加，并且在SNI損傷3天后進(jìn)一步增加。所有CD8⁺細(xì)胞均為CD68⁺以及CD3⁺細(xì)胞，這表明它們是T細(xì)胞而非巨噬細(xì)胞。此外，衰老DRG 中B細(xì)胞的數(shù)量在SNI損傷后顯著增加，但這些細(xì)胞DRG實(shí)質(zhì)外，可能是存在于周圍小靜脈中。因此，衰老與SNI前后神經(jīng)元的CXCL13表達(dá)增加、CXCR5⁺ T細(xì)胞的募集活化、以及T細(xì)胞向DRG實(shí)質(zhì)遷移有關(guān)。
 

3. 神經(jīng)元分泌的CXCL13足以招募CXCR5⁺ B細(xì)胞和T細(xì)胞到DRG，并損害軸突再生
接下來，研究者探討了神經(jīng)元CXCL13的分泌以及它的過表達(dá)是否足以將CXCR5⁺ B細(xì)胞和T細(xì)胞募集到DRG中。研究者利用AAV病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元，使其過表達(dá)CXCL13，并收集培養(yǎng)液用于隨后的體外脾細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。過表達(dá)CXCL13的培養(yǎng)基增強(qiáng)了CXCR5⁺ B細(xì)胞和T細(xì)胞的募集。
為了研究CXCL13的表達(dá)是否會影響軸突再生，研究者在體內(nèi)DRG神經(jīng)元中過表達(dá)CXCL13，并通過干擾素γ（Interferon-γ, IFN-γ)和甘露醇分別誘導(dǎo)MHC Ⅰ的表達(dá)和增強(qiáng)血液-DRG屏障的能力，隨后立即進(jìn)行SNI實(shí)驗(yàn)。與對照相比，過表達(dá)CXCL13的DRG中CXCR5⁺ B細(xì)胞和CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞均顯著增加。過表達(dá)CXCL13后坐骨神經(jīng)軸突再生顯著減少。
因此，DRG神經(jīng)元表達(dá)的CXCL13可以招募CXCR5⁺ B細(xì)胞和T細(xì)胞，并可以抑制軸突再生，部分復(fù)制了衰老表型。

4.衰老DRG中CXCL13的表達(dá)依賴NF-κB的磷酸化
為了確定轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factors, TFs）是否參與驅(qū)動衰老依賴的CXCL13表達(dá)，研究者分析了促進(jìn)CXCL13表達(dá)的TFs在衰老DRG中的表達(dá)情況。在已知的與CXCL13啟動子結(jié)合的TFs中，只有NF-κB2在衰老DRG中顯著上調(diào)。隨后，研究者用典型的NF-κB激動劑（TNF-α或IL-1β）和非典型的NF-κB激活劑（BAFF或LTα1β2）來處理培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元24小時。TNF-α和IL-1β能夠上調(diào)NF-κB1和NF-κB2的表達(dá)，但不能上調(diào)CXCL13的表達(dá)，而BAFF既不影響NF-κB的表達(dá)也不影響CXCL13的表達(dá)。然而，非典型的NF-κB激活劑LTα1β2能夠顯著增強(qiáng)NF-κB2和CXCL13的表達(dá)，這種作用可以被NF-κB激酶IKK的抑制劑PS1145減弱。NF-κB的表達(dá)和磷酸化均隨衰老而增加，但相對于對照，PS1145抑制了NF-κB的磷酸化。因此，衰老誘導(dǎo)的CXCL13的表達(dá)在PS1145中也顯著降低。此外，對磷酸化的NF-κB進(jìn)行免疫組化染色顯示，磷酸化的NF-κB在SNI前和3天后在DRG神經(jīng)元內(nèi)定位，并衰老的DRG神經(jīng)元中顯著增加。因此，年齡相關(guān)的CXCL13表達(dá)是由NF-κB驅(qū)動的。
 

5. CD8⁺ T細(xì)胞和神經(jīng)元中MHC I的表達(dá)是衰老依賴的神經(jīng)損傷再生衰退所必需的
接下來，研究者探討了CD8⁺ T細(xì)胞、CD4⁺ T細(xì)胞或B細(xì)胞是否參與了老化DRG神經(jīng)元軸突再生的衰退。在老年小鼠SNI前1周，用CD8α單克隆抗體來耗竭CD8⁺ T細(xì)胞，小鼠SNI手術(shù)后，其軸突再生能力得到顯著改善，DRG中CD8⁺ T細(xì)胞顯著減少。相比之下，CD4⁺ T細(xì)胞或B細(xì)胞的耗竭并沒有改變老年小鼠SNI后衰老相關(guān)的軸突再生衰退。這些數(shù)據(jù)表明CD8⁺ T細(xì)胞在老年動物SNI后的軸突再生能力下降中起著重要作用。

RNA-seq顯示，SNI后MHC I的表達(dá)與年齡相關(guān)。與年輕對照相比，衰老DRG中MHC I的表達(dá)在SNI前后顯著增。隨后，研究者探討了CD8⁺ T細(xì)胞是否是為限制MHC I表達(dá)的DRG神經(jīng)元軸突生長所必需。利用IFN-γ能夠誘導(dǎo)MHC I在DRG神經(jīng)元中表達(dá)，TCR轉(zhuǎn)基因的OT-I CD8⁺ T細(xì)胞在卵清蛋白肽（OVA_257–264）存在時能夠有效的降低這些表達(dá)MHC I的神經(jīng)元軸突生長、同時增加Cleaved Caspase-3水平，但沒有增加其它凋亡特征。因此，DRG神經(jīng)元的軸突生長減少依賴神經(jīng)元MHC I的表達(dá)和OT-I抗原特異性的CD8⁺ T細(xì)胞。

接下來，研究者探討了MHC I依賴性的抗原遞呈在衰老小鼠的軸突再生衰退中是否必要。為此，研究者利用AAV-GAr-rtTA病毒在衰老小鼠DRG中條件表達(dá)編碼的甘氨酸/丙氨酸多肽序列GAr，該序列可抑制MHC I抗原遞呈，從而避開CD8⁺ T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，然后進(jìn)行坐骨神經(jīng)損傷。與對照相比，AAV-GAr-rtTA感染后神經(jīng)元的MHC I和Cleaved Caspase-3表達(dá)顯著降低，坐骨神經(jīng)軸突再生顯著增強(qiáng)。因此，SNI后衰老相關(guān)的神經(jīng)再生衰退依賴于CD8⁺ T細(xì)胞和神經(jīng)元MHC I的表達(dá)。
 

6. CD8⁺ T細(xì)胞依賴的神經(jīng)元Caspase-3激活抑制了pAKT和pS6信號，這與衰老相關(guān)的軸突再生失敗有關(guān)
為了闡述CD8⁺ T細(xì)胞依賴性的衰老相關(guān)的再生衰退的分子信號。在SNI后3天，老年小鼠DRG神經(jīng)元中Cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著增加，而其中與凋亡相關(guān)的DNA片段缺失。SNI損傷后，老年DRG神經(jīng)元中Perforin和Granzyme B的表達(dá)顯著增加。激活Caspase 3可導(dǎo)致AKT截?cái)嗪虯KT磷酸化水平降低，進(jìn)而降低S6磷酸化水平。pAKT和pS6與軸突再生相關(guān)，并且通常會隨著年齡的增長而受損。事實(shí)上，在SNI后第3天，衰老DRG中pAKT和pS6水平下降，然而，這種效應(yīng)在CD8⁺ T細(xì)胞耗竭后被顯著逆轉(zhuǎn)。CD8⁺ T細(xì)胞耗竭顯著增強(qiáng)了DRG神經(jīng)元中的pAKT和pS6的表達(dá)，同時減少了Cleaved Caspase-3、Perforin、和Granzyme B的表達(dá)。最后，利用Z-DEVD-FMK抑制Caspase-3能夠顯著增加pAKT和pS6，并增加坐骨神經(jīng)的軸突再生。因此，在SNI后衰老DRG神經(jīng)元中，CD8⁺ T細(xì)胞依賴的Caspase-3激活會抑制pAKT和pS6，而抑制Caspase-3的激活可促進(jìn)神經(jīng)損傷后軸突再生。
 

7. CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞驅(qū)動SNI后衰老依賴的軸突再生衰退
接下來，研究者試圖確定CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞是否直接導(dǎo)致SNI后軸突再生能力下降。CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞被分離并移植到缺乏B細(xì)胞和T細(xì)胞的年輕或年老的OT-I Rag2^-/-小鼠體內(nèi)。在細(xì)胞移植之前，老年OT-I Rag2^-/-小鼠無論CD8⁺ T細(xì)胞是否耗竭，其神經(jīng)再生能力相對于野生型小鼠顯著增加。因此，內(nèi)生的OT-I CD8 + T細(xì)胞對神經(jīng)再生沒有影響。

然后，研究者探究了CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞的移植是否足以限制老年小鼠SNI后坐骨神經(jīng)的再生。將CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞注射到年輕或年老的OT-I Rag2^-/-小鼠體內(nèi)。CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞充分地浸潤到年老而非年輕小鼠DRG中，相反，CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞在年輕小鼠的脾臟中積累更多。CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞的這些遷移模式與DRG和脾臟中不同的CXCL13水平相關(guān)。此外，CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞在老年小鼠的血液中增加。最后，CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞移植導(dǎo)致老年小鼠坐骨神經(jīng)損傷后軸突再生顯著降低。CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞移植導(dǎo)致老年小鼠DRG神經(jīng)元中Perforin的表達(dá)顯著增加、pS6的表達(dá)顯著下降，而在年輕小鼠的DRG中沒有發(fā)現(xiàn)這些變化。
 

8. CXCL13拮抗劑阻斷CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞的募集，挽救了SNI傷后衰老依賴的軸突再生衰退已經(jīng)證明CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞的募集會導(dǎo)致軸突再生失敗，作者探究了這些細(xì)胞是如何募集的。將分選的野生型CD8⁺ T細(xì)胞或Cxcr5^-/- CD8⁺ T細(xì)胞移植到OT-I Rag2^-/-小鼠體內(nèi)，小鼠在SNI手術(shù)前用對照免疫球蛋白G或CXCL13單克隆抗體處理。DRG中Cxcr5^-/- CD8⁺ T細(xì)胞的募集明顯低于野生型CD8⁺ T細(xì)胞。CXCL13單克隆抗體顯著降低了CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞向DRG以及脾臟的遷移。CXCL13拮抗顯著增強(qiáng)了移植野生型CD8⁺ T細(xì)胞而非移植Cxcr5^-/- CD8⁺ T細(xì)胞小鼠的SNI后軸突再生能力。因此，在衰老DRG中，CD8⁺ T細(xì)胞的遷移和限制坐骨神經(jīng)再生需要依賴CXCL13作用于其受體CXCR5。
 

9. CXCL13中和逆轉(zhuǎn)了衰老依賴的再生衰退，促進(jìn)了SNI后的神經(jīng)功能恢復(fù)
最后，作者研究了CXCL13中和是否能促進(jìn)衰老動物的軸突再生、表皮神經(jīng)支配以及神經(jīng)功能恢復(fù)。給予CXCL13單克隆抗體顯著提高了老年小鼠體外培養(yǎng)DRG神經(jīng)元的軸突再生，減少了CXCR5⁺ T細(xì)胞和B細(xì)胞的募集，阻止了衰老依賴的坐骨神經(jīng)再生失敗以及SNI后DRG中CD8⁺ T細(xì)胞的浸潤。此外，作者測試了拮抗CXCL13對神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。CXCL13中和顯著加速了老年小鼠感覺功能的恢復(fù)。CXCL13中和能顯著促進(jìn)老年小鼠后爪皮膚神經(jīng)再生。因此，CXCL13中和能促進(jìn)老年動物軸突再生、皮膚神經(jīng)再生和神經(jīng)功能恢復(fù)。
 

總結(jié)
該研究表明，衰老通過一種CXCL13依賴機(jī)制，調(diào)控CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞進(jìn)入DRG，導(dǎo)致軸突損傷后DRG神經(jīng)元軸突的再生失敗。再生失敗是CXCL13依賴的CXCR5⁺ CD8⁺ T細(xì)胞的DRG募集的結(jié)果，這些細(xì)胞通過DRG神經(jīng)元表面的MHC I與神經(jīng)元交流，從而驅(qū)動軸突再生抑制信號。因此，該研究的結(jié)果提示，CXCL13中和可能可以用于治療老年人的神經(jīng)損傷。更普遍的講，這些結(jié)果描述了特定年齡的神經(jīng)再生機(jī)制，表明這些有針對性的干預(yù)措施需要考慮損傷或疾病開始時的年齡。
 

亮點(diǎn)研究方法
這項(xiàng)工作闡述了衰老依賴的神經(jīng)再生失敗的細(xì)胞分子機(jī)制。研究用到了動物手術(shù)造模、組織病理檢測、細(xì)胞分子檢測、給藥以及行為學(xué)評估等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。瑞沃德深耕生命科學(xué)研究領(lǐng)域20年，一直致力于為客戶提供可信賴的解決方案和服務(wù)，可提供的該研究中涉及的動物手術(shù)造模、行為學(xué)評估、光遺傳學(xué)、電生理記錄、組織病理檢測、給藥以及分子檢測等實(shí)驗(yàn)的完整解決方案。截至目前，瑞沃德產(chǎn)品及服務(wù)覆蓋海內(nèi)外 100 多個國家和地區(qū)，客戶涵蓋全球700+醫(yī)院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全球科研人員發(fā)表SCI文章14500+，獲得行業(yè)廣泛認(rèn)可。

原文鏈接：
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abd5926