IRAK1和IRAK4是組織中廣泛表達(dá)的經(jīng)典激酶，而IRAK3是一種假激酶，只在骨髓細(xì)胞系中表達(dá)，缺乏激酶活性。迄今為止，沒有傳統(tǒng)小分子抑制劑靶向IRAK3，2020年，Degorce等報道了第一個選擇性降解IRAK3靶點(diǎn)的PROTAC分子，但相關(guān)研究沒有揭示降解后功能變化。IRAK3作為TLR通路的負(fù)調(diào)控因子，可能會降低先天免疫反應(yīng)。在腫瘤微環(huán)境中，敲除IRAK3顯示骨髓細(xì)胞功能增強(qiáng)以促進(jìn)抗腫瘤響應(yīng)。與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的單核細(xì)胞顯示 TNF-α、IL-12 和 IRAK1 表達(dá)降低，但 IRAK3 表達(dá)增加。相反，與野生型 (WT) 樹突狀細(xì)胞（DCs） 相比，IRAK3-/-小鼠樹突狀細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加，從而誘導(dǎo) T 細(xì)胞反應(yīng)并導(dǎo)致腫瘤生長抑制，降解IRAK3可能成為免疫腫瘤治療中一個有吸引力新策略。IL-12是由活化的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)出的主要促炎細(xì)胞因子，通過誘導(dǎo)促IFN-γ細(xì)胞因子，在促進(jìn)Th1介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)、T細(xì)胞活化和增殖中發(fā)揮重要作用。

通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和PROTAC選擇性降解IRAK3來研究后續(xù)DCs中功能和表型變化。根據(jù)下圖在人單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞中基因編輯敲除IRAK3基因，采用基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的Digital Western（也稱為Simple Western Wes系統(tǒng)）驗證基因敲除效率，2個供體顯示完全敲除，另一個顯示保留10% IRAK3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示通過CRISPR/Cas9 RNP方法有效降低了DCs中IRAK3蛋白表達(dá)水平。敲除了IRAK3后，在脂多糖（LPS）刺激后，通過檢測細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子分泌水平，結(jié)果顯示IL-12p40分泌顯著增加，與對照相比，濃度增加了1.5到2倍。同時IL-12p70分泌也具有增長趨勢，但I(xiàn)L-10沒有影響。

 

采用PROTAC D-1和LPS處理的DCs中IL-12p40濃度增加與CRISPR/Cas9 KO實驗結(jié)果一致的，證明了兩種方法有效性，證明通過PROTAC蛋白降解劑對IRAK3靶點(diǎn)可成藥性。通過深入了解研究IRAK3生物學(xué)，擴(kuò)大了PROTAC分子降解靶點(diǎn)庫，并支持了潛在治療靶點(diǎn)的基因編輯缺失和化學(xué)降解之間的相關(guān)性。
 

本研究主要利用Digital Western Blot技術(shù)檢測IRAK3靶蛋白表達(dá)水平，研究CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和PROTAC蛋白降解技術(shù)處理后細(xì)胞蛋白表達(dá)，準(zhǔn)確定量靶向蛋白降解研究過程量效關(guān)系。AbbVie公司研究再次證明了Digital Western Blot可快速地、可重復(fù)性精準(zhǔn)定量內(nèi)源性蛋白質(zhì)表達(dá)，是PROTAC技術(shù)平臺構(gòu)建的必備技術(shù)。

 

PROTAC 是 Arvinas, Inc. 注冊商標(biāo)，其他商標(biāo)和注冊商標(biāo)是其各自所有者的財產(chǎn)。

 

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參考文獻(xiàn)

1. Rhyasen, G., Starczynowski, D. IRAK signalling in cancer. Br J Cancer 112, 232–237 (2015).

2. Ann Rowley, Brian S Brown, etc. Targeting IRAK3 for Degradation to Enhance IL-12 Pro-inflammatory Cytokine Production.ACS Chem Biol. 2022 May 17