層流剪切應(yīng)力通過HMGB1核轉(zhuǎn)位激活人主動脈內(nèi)皮細胞的自噬來抑制炎癥
 

隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展和人口老齡化，動脈粥樣硬化（AS）引起的心腦血管疾病已成為嚴重威脅人類生命健康的最重要疾病之一。AS 的發(fā)展過程涉及內(nèi)皮細胞炎癥損傷。

層流剪切應(yīng)力（LSS）通過影響血管內(nèi)皮細胞的基因表達，在抗炎、抗粘連、抗衰老、保護內(nèi)皮細胞等方面發(fā)揮重要作用，從而延緩 AS 的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，巨噬細胞在破壞 AS 斑塊方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，靶向自噬治療 AS 具有重要的臨床意義。LSS 和內(nèi)皮細胞自噬之間的關(guān)系已被廣泛研究。暴露于 LSS 的人主動脈內(nèi)皮細胞（HAECs）和牛主動脈內(nèi)皮細胞也表現(xiàn)出更高程度的細胞內(nèi)自噬，表明自噬可能是 LSS 在 AS 中保護作用的關(guān)鍵執(zhí)行因子。

HMGB1 是一種普遍存在的核蛋白，它與 DNA 結(jié)合，有助于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。HMGB1 被認為是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。酪氨酸蛋白激酶受體B2（EPHB2）也廣泛參與自噬的研究。研究表明，EPHB2 介導(dǎo)的正向信號通路可以激活自噬以減輕 Aβ 誘導(dǎo)的 HT22 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡。然而，HMGB1 和 EPHB2 的關(guān)系至今仍然沒有得到很好的表征。

近年來，長鏈非編碼 RNAs（lncRNA）已成為基因表達網(wǎng)絡(luò)中的重要“調(diào)節(jié)劑”。研究表明，lncRNA，AF131217.1，通過競爭性結(jié)合 miR-128-3p 來調(diào)節(jié) HUVECs 中 Kruppel 樣因子4 的表達，從而發(fā)揮抗炎作用。然而，在 LSS 下，lncRNAs 在 HAECs 中的表達和功能仍不清楚。

吉林大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院人畜共患病研究教育部重點實驗室、吉林大學(xué)第一醫(yī)院心血管疾病診治中心課題組的一項研究采用全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析 LSS 作用于 HAECs 后 EPHB2 的表達，驗證了 LSS 作用下 EPHB2 與 HMGB1 的相互作用，同時鑒定了一種新的 LSS 敏感 lncRNA LOC10798635，并構(gòu)建了 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 調(diào)控軸，進一步揭示了 LSS 通過激活自噬抑制內(nèi)皮細胞炎癥的分子機制。

LSS 通過激活內(nèi)皮細胞自噬抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

為了探索 LSS、自噬和內(nèi)皮細胞炎癥之間的關(guān)系，選擇 HAECs 和 HUVECs 作為體外模型，兩種細胞類型均用 12 dyn/cm² LSS 處理 12 小時，然后去除 LSS 使細胞恢復(fù)穩(wěn)定培養(yǎng) 24 小時。結(jié)果表明，LSS 作用于內(nèi)皮細胞后，自噬標志蛋白 MAP1LC3B2 的表達增加，而 SQSTM1/P62 的表達降低，表明 LSS 顯著激活了自噬。然而，LSS 撤除后自噬激活消失，說明 LSS 與內(nèi)皮細胞自噬密切相關(guān)。

然后使用 TNF-α 刺激內(nèi)皮細胞炎癥，觀察 LSS 的抗炎作用。結(jié)果表明，TNF-α 顯著上調(diào) HAECs 和 HUVECs 中 ICAM-1、VCAM-1、COX-2 和 MMP-9 的表達。然而，LSS 抑制了 HAECs 和 HUVECs 中 TNF-α 誘導(dǎo)的炎癥因子濃度，同時，自噬被顯著激活。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)自噬通路被 3-MA 或 BECN1 siRNA 抑制時，LSS 的抗炎作用消失，表明 LSS 可以通過激活自噬來抑制內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)。

全轉(zhuǎn)錄組測序分析表明 EPHB2 是響應(yīng) LSS 的關(guān)鍵基因

為了觀察 LSS 應(yīng)用前后內(nèi)皮細胞基因表達的變化，對三組 HAECs（靜態(tài)、LSS 和 LSS 后）進行了全轉(zhuǎn)錄組測序。實驗將 LSS 后上調(diào)基因、恢復(fù)穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)后下調(diào)基因以及靜態(tài)和 LSS 后表達沒有變化的基因進行交集，最終得到 96 個差異表達（DE）mRNAs。

96 個 DE mRNAs 的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析顯示，EPHB2 具有更高的結(jié)合評分，并且 EPHB2 與自噬和 AS 密切相關(guān)。因此選擇 EPHB2 作為核心調(diào)控基因，利用 Cytoscape 軟件構(gòu)建以 EPHB2 為核心的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。同時檢測 EPHB2 在三組內(nèi)皮細胞中的表達。定量實時聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡表明，EPHB2 表達因 LSS 顯著升高，而去除 LSS 后降低，表明 EPHB2 是 HAECs 中響應(yīng) LSS 的關(guān)鍵基因。

LSS 通過增強 EPHB2 介導(dǎo)的 HMGB1 核轉(zhuǎn)位激活自噬通量

接下來探討了 LSS 通過 EPHB2 激活內(nèi)皮細胞自噬的能力是否與 HMGB1 的核轉(zhuǎn)位有關(guān)。首先，EPHB2、HMGB1 和 BECN1 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析表明，它們?nèi)�者之間存在交互作用（圖1 h），然后提取 HAECs 的核質(zhì)蛋白，結(jié)果顯示 HMGB1 在 LSS 的作用下被轉(zhuǎn)運出細胞核，而在 EPHB2 表達被抑制后這種現(xiàn)象消失了（圖1 i）。當(dāng)將表達 GFP-HMGB1 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 HAECs 中時，也觀察到了一致的現(xiàn)象（圖1 j、k）。

為了探究 LSS 刺激的 HAECs 中 EPHB2 和 HMGB1 之間的關(guān)系，采用免疫共沉淀法觀察它們是否可以相互作用，結(jié)果表明，EPHB2 和 HMGB1 之間存在相互作用（圖1 l）。隨后的免疫熒光實驗證明，HMGB1 在 LSS 的作用下可以離開細胞核并與 EPHB2 共定位（圖1 m）。
 

圖1 LSS 通過增強 EPHB2 介導(dǎo)的 HMGB1 核轉(zhuǎn)位來激活自噬通量。（h）EPHB2、HMGB1 和 BECN1 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)功能富集分析。（i）核質(zhì)分離實驗表明HMGB1具有亞細胞定位。（j、k ） 使用GFP-HMGB1質(zhì)粒在激光共聚焦顯微鏡下觀察HMGB1的核轉(zhuǎn)位。（l）共免疫沉淀實驗顯示了在LSS作用下HAECs中HMGB1和EPHB2之間的物理相互作用，細胞裂解物經(jīng)抗HMGB1抗體免疫沉淀。（m）免疫熒光測定顯示在 LSS 的作用下 EPHB2 和 HMGB1 在 HAECs 中的共定位。

接下來驗證 EPHB2 的過表達是否可以通過誘導(dǎo) HMGB1 的核轉(zhuǎn)位發(fā)揮與 LSS 相同的抗炎作用。實驗觀察到，EPHB2 的過表達可以誘導(dǎo) HMGB1 的核轉(zhuǎn)位，然后與 EPHB2 相互作用，并且甘草酸（GA，HMGB1 的抑制劑）還可以通過抑制自噬來抵消 EPHB2 過表達的抗炎作用。此外，當(dāng)用 HMGB1 siRNA 轉(zhuǎn)染 HAECs 時，LSS 的抗炎作用和EPHB2的過表達降低，伴隨著 MAP1LC3B2 表達的降低和 SQSTM1/P62 表達的增加。這表明，EPHB2 過表達可激活自噬，發(fā)揮與 LSS 相同的抗炎作用。

LSS 相關(guān) LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過全轉(zhuǎn)錄組測序獲得的lncRNAs數(shù)據(jù)，結(jié)果兩種lncRNA的表達符合預(yù)期，相應(yīng)的 LOC107986345和 LOC107986196 通過 qRT-PCR 驗證。隨后構(gòu)建了 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 和 LOC107986196/miR-128-3p/EPHB2 調(diào)節(jié)軸。后續(xù)只有LSS相關(guān)的LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2調(diào)節(jié)軸經(jīng)過成功驗證。實驗表明，EPHB2 與 miR-128-3p 具有很強的靶向關(guān)系。

為了進一步驗證 miR-128-3p 是否可以與 LOC107986345 和 EPHB2 結(jié)合，使用了 RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）技術(shù)。RIP 的結(jié)果表明 miR-128-3p 可以與 LOC107986345 和 EPHB2 結(jié)合。過表達和敲低 miR-128-3p 的結(jié)果也證明 LOC107986345、miR-128-3p 和 EPHB2 可以相互調(diào)控。

LSS 對內(nèi)皮炎癥的抑制取決于 HMGB1 通過 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸的核易位引起的自噬激活

先前的結(jié)果表明，LSS 不僅能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞自噬，還能激活 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸。因此，實驗推測 LSS 通過 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞自噬。使用來自 HAECs 的透射電子顯微鏡（TEM）圖像研究了 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸誘導(dǎo)的自噬的影響。結(jié)果清楚地顯示了用不同載體處理時 HAECs 中的自噬體和自噬溶酶體，這種介導(dǎo)作用是由于激活 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸誘導(dǎo)的自噬而不是抑制溶酶體降解通路（圖2 c-e）。這表明，LSS 通過 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞自噬。

為了進一步探索 LSS 通過 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸介導(dǎo)的自噬是否可以抑制內(nèi)皮細胞炎癥，首先使用單核細胞粘附實驗表明，THP-1 對內(nèi)皮細胞的粘附在 TNF- α 刺激下明顯增強。然而，通過激活 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸，這種粘附顯著減弱（圖2 f、g）。實驗還測量了相關(guān)炎癥因子和自噬標記蛋白的表達。結(jié)果表明，LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸介導(dǎo)的自噬可以抑制內(nèi)皮細胞炎癥（圖2 h、i）。此外，當(dāng)用 HMGB1 siRNA 轉(zhuǎn)染 HAECs 時，通過激活 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸的抗炎作用降低，伴隨著 MAP1LC3B2 表達的降低和 SQSTM1/P62 表達的增加（圖2 j-m）。這表明 LSS 對內(nèi)皮細胞炎癥的抑制取決于通過 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸 HMGB1 的核易位導(dǎo)致的自噬激活。
 

圖2 （c-e）Western Blot 顯示 MAP1LC3B2 的表達。（f、g）共聚焦顯微鏡顯示 pri-LOC107986345、sh-miR-128-3p 和 pri-EPHB2 抑制單核細胞粘附的作用。（h、i ）Western Blot 顯示 pri-LOC107986345、sh-miR-128-3p 和 pri-EPHB2 的抗炎作用。（j、k） Western Blot顯示HMGB1 siRNA對pri-LOC107986345的抗炎作用的影響。（m）Western Blot 顯示 HMGB1 siRNA 對 sh-miR-128-3p 的抗炎作用的影響。
 

圖3 圖形概要

該研究結(jié)果表明，LSS 可以通過激活 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸來誘導(dǎo) HMGB1 的核轉(zhuǎn)位，HMGB1 核轉(zhuǎn)位后 HAECs 的自噬通路被迅速激活。然而，當(dāng)抑制 HMGB1 時，上述自噬水平顯著降低，相應(yīng)地，LSS 的抗炎能力也降低。這表明 LSS 對內(nèi)皮細胞炎癥的抑制取決于通過激活 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸的 HMGB1 核易位導(dǎo)致的自噬激活（圖3）。

未來的研究方向可以探索 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸與振蕩剪切應(yīng)力（OSS）之間的關(guān)系。例如，在這些促動脈粥樣硬化的流動條件下，該軸是否下調(diào)？上調(diào)該軸是否會預(yù)防 OSS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥？從而從另一個方面驗證 LOC107986345/miR-128-3p/EPHB2 軸在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

參考文獻：Meng Q, Pu L, Qi M, Li S, Sun B, Wang Y, Liu B, Li F. Laminar shear stress inhibits inflammation by activating autophagy in human aortic endothelial cells through HMGB1 nuclear translocation. Commun Biol. 2022 May 6;5(1):425. doi: 10.1038/s42003-022-03392-y. PMID: 35523945; PMCID: PMC9076621.

原文鏈接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/35523945/

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