01 熒光蛋白的由來(lái)

圖2. 熒光蛋白發(fā)展史 (A)， FPs的系統(tǒng)發(fā)育樹（B）

02 熒光蛋白的分類
 

RFPs（紅色熒光蛋白）：

• mCherry具有優(yōu)異光穩(wěn)定性，是最通用紅色單體（但融合表達(dá)時(shí)有較弱的齊聚效應(yīng)）
• tdTomato具有mCherry相同的光穩(wěn)定性，亮度更強(qiáng)，是追蹤表達(dá)水平的理想選擇，但為串聯(lián)二聚體，可以在融合標(biāo)簽大小不干擾蛋白質(zhì)功能的情況下使用
• mStrawberry是最亮的紅色單體，但光穩(wěn)定性要弱于mCherry
• DsRed是細(xì)胞毒性最小的RFP
• mApple在蛋白的融合表達(dá)中是mCherry理想的替代物，但其光穩(wěn)定性要遠(yuǎn)弱于mCherry
• mKate2從參數(shù)方面考量是綜合亮度、光穩(wěn)定性和齊聚性的最佳RFP，但目前報(bào)道相對(duì)較少

OFPs（橙色熒光蛋白）：

• mOrange是最亮的橙色單體

YFPs（黃色熒光蛋白）：

• YPet具有極高的光穩(wěn)定性且成熟快,亮度極高
• mVenus是亮度極高的黃色單體

GFPs（綠色熒光蛋白）：

• EGFP是目前適用范圍最廣的FP，綜合多個(gè)優(yōu)勢(shì)屬性
• GFP是最早發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白，應(yīng)用廣泛

CFPs（青色熒光蛋白）：

• mTurquoise是最亮的青色單體
• CyPet是最穩(wěn)定的CFP

BFPs（藍(lán)色熒光蛋白）：

• mTagBFP2是最穩(wěn)定，成熟極快、亮度極亮的藍(lán)色單體

 

 

• 激發(fā)波與發(fā)射波——我們選擇的光學(xué)系統(tǒng)需能夠有激發(fā)FP合適的激發(fā)光，并同時(shí)有檢測(cè)FP發(fā)射光的合適通道
• 齊聚度——融合表達(dá)時(shí)，選擇易齊聚的FP可能會(huì)影響其融合蛋白的生物學(xué)功能或定位，此時(shí)應(yīng)盡量選擇單體FP
• 亮度——選擇足夠亮的FP才能提供足夠信號(hào)以便檢測(cè)和成像
• 光穩(wěn)定性--FP應(yīng)具有足夠的光穩(wěn)定性以使其穩(wěn)定成像
• 成熟時(shí)間--FP正確折疊并形成發(fā)色基團(tuán)所需的時(shí)間
• pH穩(wěn)定性--某些FP隨著pH的變化會(huì)改變熒光強(qiáng)度，可用于檢測(cè)pH變化/胞吐作用
• 分子氧--許多FP上的發(fā)色基團(tuán)成熟需要氧氣，因此該類FP不能在缺氧環(huán)境使用
• 溫度--FP的成熟時(shí)間和熒光強(qiáng)度會(huì)受到溫度的影響，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)溫度環(huán)境選擇FP

有了上文提到的八要素評(píng)價(jià)體系后，我們就該考慮在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中如何運(yùn)用這些熒光蛋白。
 4.1   用于蛋白的亞細(xì)胞定位研究‍

將示蹤基因敲入到小鼠內(nèi)源基因的或5'端或3'端，且與內(nèi)源基因融合表達(dá)，可以確定內(nèi)源蛋白的亞細(xì)胞定位（如圖3所示）。熒光標(biāo)簽插入位置的決定因素：1. 已有文獻(xiàn)的報(bào)道，首先考慮已有的參考模型；2. N端或C端有無(wú)蛋白修飾，避免插入的位置進(jìn)行蛋白翻譯后的修飾；3. 離主要功能域遠(yuǎn)的N端或C端，確保蛋白正常功能的行使�？傊�，熒光標(biāo)簽插入的位置應(yīng)盡量避免影響蛋白的正常功能。
 
例如，中科院生化所張雷、周斌等[6]發(fā)現(xiàn)Vgll4基因全身敲除小鼠大部分會(huì)出生前死亡，而少部分存活的小鼠體型偏小、有嚴(yán)重的心肌肥大，還伴有心臟血液回流以及心臟瓣膜異常增厚等癥狀。隨后他們通過(guò)構(gòu)建Vgll4-EGFP熒光示蹤小鼠觀察Vgll4基因的表達(dá)時(shí)間及亞細(xì)胞定位（如圖4所示），發(fā)現(xiàn)Vgll4基因從胚胎期的13.5天開始表達(dá)在小鼠主動(dòng)脈瓣、肺動(dòng)脈瓣間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中，并持續(xù)表達(dá)在成體心臟動(dòng)脈瓣膜的間充質(zhì)細(xì)胞中。這些結(jié)果首次闡明了作為Hippo信號(hào)通路拮抗劑的VGLL4在心臟瓣膜發(fā)育以及穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程中的重要功能，為心臟瓣膜疾病的預(yù)防和治療提供了新的靶點(diǎn)。
 
 4.2   用于蛋白的表達(dá)譜研究‍

常見的有兩種方式。第一種方式是，將熒光示蹤基因通過(guò)2A（自剪切多肽）或IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列）敲入到小鼠內(nèi)源基因的3'端，對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)進(jìn)行示蹤（如圖5所示）；第二種方式是，將熒光基因敲入到小鼠內(nèi)源基因的5'端，通過(guò)終止序列polyA與內(nèi)源基因連接，可以實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因的替代表達(dá)，通過(guò)觀察熒光示蹤基因的表達(dá)了解內(nèi)源性蛋白的表達(dá)情況，例如：是否表達(dá)、表達(dá)量、表達(dá)組織分布等等。
 
例如，為尋找激活褐色脂肪細(xì)胞的小分子物質(zhì)，研究人員在褐色脂肪成熟標(biāo)志物解偶聯(lián)蛋白(UCP1)終止密碼子前定點(diǎn)敲入綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)框，建立了成熟褐色脂肪組織細(xì)胞熒光示蹤的小鼠模型（如圖6所示）。隨后作者喂食熒光示蹤小鼠1000余種臨床用藥通過(guò)觀察熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)體內(nèi)Ucp1基因的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sutent能顯著促進(jìn)褐色脂肪細(xì)胞中UCP1的表達(dá)。本研究結(jié)合熒光標(biāo)記的基因示蹤小鼠模型和大規(guī)�；�合物篩選，建立了一個(gè)篩選調(diào)控褐色脂肪組織細(xì)胞激活劑的高效實(shí)驗(yàn)體系，也為肥胖及相關(guān)代謝型疾病研究提供了新的思路[7]。
 
 4.3   用于細(xì)胞系示蹤的研究‍

利用Rosa26-LSL-reporter示蹤小鼠，與特定細(xì)胞標(biāo)記基因敲入Cre的工具小鼠交配，在子代小鼠中特定類型細(xì)胞被永久標(biāo)記上報(bào)告基因熒光（如圖7所示），通過(guò)觀察這些被標(biāo)記上的熒光信號(hào)可以追蹤某類特定細(xì)胞及其后代所有細(xì)胞的增殖、分化以及遷移等活動(dòng)，為研究細(xì)胞命運(yùn)及譜系提供有力手段。
 
例如，研究人員利用基于Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組的報(bào)告基因小鼠R26-RSR -LSL-tdTomato，并結(jié)合能特異性標(biāo)記CC10+細(xì)胞的Scgb1a1-CreER小鼠和特異性標(biāo)記SPC+細(xì)胞的Sftpc-DreER小鼠，通過(guò)交配獲得Scgb1a1-CreER;Sftpc –DreER ; R26-RSR-LSL-tdTomato（BASCs tracer）三基因型小鼠來(lái)特異性標(biāo)記CC10+SPC+BASCs。通過(guò)體內(nèi)驗(yàn)證，此策略能特異性地標(biāo)記示蹤BASCs。研究發(fā)現(xiàn)位于支氣管肺泡交界處的BASCs（肺支氣管肺泡干細(xì)胞）具有多種肺上皮細(xì)胞分化的潛能，并結(jié)合多種小鼠損傷模型揭示了這群干細(xì)胞在體內(nèi)具有再生肺臟的能力，為肺臟的修復(fù)和再生研究提供了新的研究方向及理論基礎(chǔ)[8]。
 
 4.4   用于多色實(shí)驗(yàn)‍

無(wú)論在融合表達(dá)還是非融合表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，我們時(shí)常會(huì)面臨需要選擇多個(gè)熒光蛋白進(jìn)行共成像的實(shí)驗(yàn)需求，例如追蹤多基因表達(dá)水平、亞細(xì)胞定位、研究蛋白互作和細(xì)胞篩選等。
 
選擇熒光蛋白進(jìn)行多色實(shí)驗(yàn)時(shí)除了考慮上述提到的基本八要素，還要兼顧熒光蛋白的兼容性。其中，選擇兼容熒光蛋白遵守的原則是：選擇不同熒光的峰值激發(fā)波長(zhǎng)和峰值發(fā)射波長(zhǎng)都應(yīng)分開50-60 nm以上。

例如，CFP（ex 430 nm / em 474 nm）和YFP（ex 514 nm / em 527 nm）可以一起成像，但CFP和GFP（ex 488 nm / em 507 nm）在顯示時(shí)會(huì)存在一些串?dāng)_。

目前一些比較常用的多色FPs組合：

雙熒光（綠-紅）：
EGFP+mCherry
EGFP+tdTomato
EGFP+mKate2

雙熒光（青-黃）：
CyPet+YPet

三熒光（藍(lán)綠紅/青黃紅）：
mTagBFP2+EGFP+mCherry
mTagBFP2+EGFP+tdTomato
mTagBFP2+EGFP+mKate2
CyPet+YPet+mCherry
CyPet+YPet+mKate2

希望今天的干貨分享對(duì)每一位熒光蛋白的使用者有所幫助，在選擇熒光蛋白時(shí)，不再迷茫！

參考文獻(xiàn)：

1 Shaner, N C, Steinbach P A, Tsien R Y. A guide to choosing fluorescent proteins[J]. Nature Methods, 2005，2(12), 905–909. 

2 Kremers G J , Gilbert S G , Cranfill P J , et al. Fluorescent proteins at a glance[J]. Journal of Cell Science, 2011, 124(2):157-60.
3 Carroll K J, Makarewich C A, McAnally J, et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015，113(2), 338–343.
4 Snapp E. Design and use of fluorescent fusion proteins in cell biology[J]. Current Protocols in Cell Biology, 2005, 27(1).
5 Addgene: eBooks
6. YuW, MaX, XuJ, et al. VGLL4plays a critical role in heart valve development and homeostasis. PLoS Genet. 2019 Feb 21; 15(2):e1007977.
7.  QiuY, SunY, XuD, et al.Screening of FDA-approved drugs identifies sutent as modulator of UCP1expression in brown adipose tissue. EBioMedicine. 2018 Nov; 37:344-355.LiuQ, 3. LiuK, CuiG, et al. Lung regenerationby multipotent stem cells residing at the bronchioalveolar-duct junction. NatGenet.2019 Apr; 51(4):728-738.
8.Nat Genet . 2019 Apr;51(4):728-738. doi: 10.1038/s41588-019-0346-6. Epub 2019 Feb 18. Lung regeneration by multipotent stem cells residing at the bronchioalveolar-duct junction